上(shàng)一(yī / yì ／yí)期小賽給大(dà)家分享了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)篇KingFisher純化細胞的(de)文章，獲得了(le／liǎo)很多小夥伴的(de)關注，這(zhè)次小賽又給您帶來(lái)了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)篇KingFisher做蛋白純化的(de)文章，KingFisher儀器不(bù)僅能用于(yú)新冠病毒的(de)檢測，還能用于(yú)新冠藥物靶點的(de)研究。

2020年5月，一(yī / yì ／yí)篇名爲(wéi / wèi) “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 的(de)重磅論文在(zài)Nature上(shàng)發表，推動治療新冠藥物的(de)研發進程。論文通過揭示SARS-CoV-2病毒與人(rén)類蛋白相互作用（protein–protein interaction, PPI）的(de)圖譜來(lái)揭示病毒如何劫持細胞系統，找到(dào)了(le／liǎo)332個(gè)SARS-CoV-2蛋白與人(rén)類蛋白質之(zhī)間的(de)相互作用關系，并鑒定出(chū)69種能靶向幹擾的(de)化合物。這(zhè)項研究無論對于(yú)“老藥新用”治療新冠疾病，還是(shì)對于(yú)指明新藥的(de)研發方向，都有重要(yào / yāo)的(de)意義。

值得一(yī / yì ／yí)提的(de)是(shì)

科學家在(zài)研究中使用了(le／liǎo)全自動純化系統KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) 和(hé / huò)質譜分析儀Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific) 來(lái)實現親和(hé / huò)純化質譜（affinity purification mass spectrometry，AP-MS），找到(dào)了(le／liǎo)藥物靶點，爲(wéi / wèi)新冠藥物開發助力。

研究方法

他(tā)們首先單獨研究了(le／liǎo) 29 種 SARS-CoV-2 蛋白中的(de) 26 種（表1）。

表1. SARS-CoV-2蛋白表，包括分子(zǐ)質量、與SARS-CoV同源物的(de)序列相似性以(yǐ)及基于(yú)SARS-CoV同源物的(de)推斷功能。

如何找到(dào)這(zhè)26種病毒蛋白會與人(rén)體裏的(de)哪些蛋白産生相互作用呢？

研究人(rén)員利用在(zài) HEK293T/17 細胞中表達的(de)病毒蛋白進行親和(hé / huò)純化質譜（AP-MS）。SARS-CoV-2 病毒蛋白經過密碼子(zǐ)優化并克隆到(dào)帶有親和(hé / huò)标簽（或誘餌）的(de)哺乳動物表達載體中。在(zài)宿主細胞中表達這(zhè)些病毒蛋白後，通過高通量的(de)純化系統KingFisher Flex，在(zài)與宿主蛋白相互作用的(de)背景下純化病毒蛋白并通過多次純化洗滌，盡量避免雜蛋白的(de)幹擾。結合質譜分析得到(dào)的(de)數據，生成SARS-CoV-2蛋白和(hé / huò)人(rén)類蛋白之(zhī)間的(de) PPI 圖譜（圖1）。

圖1. AP-MS鑒定SARS-CoV-2宿主蛋白-蛋白質相互作用的(de)實驗流程。

根據這(zhè)些蛋白相互作用的(de)數據，科學家們在(zài)已經批準的(de)藥物、正在(zài)臨床試驗的(de)藥物、以(yǐ)及尚未進入臨床試驗的(de)化合物中，尋找能夠選擇性幹擾病毒蛋白-人(rén)類蛋白相互作用的(de)分子(zǐ)。

爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)進一(yī / yì ／yí)步證明藥物的(de)抗病毒性，研究團隊與兩個(gè)正在(zài)實驗室中處理 SARS-CoV-2 病毒的(de)研究小組合作，在(zài) Vero 細胞培養病毒檢測中測試病毒。

主要(yào / yāo)發現1

繪制SARS-CoV-2病毒蛋白與人(rén)體蛋白相互作用網絡

研究團隊首次系統分析了(le／liǎo)SARS-CoV-2在(zài)感染過程中可能與哪些人(rén)類蛋白質相互作用。用親和(hé / huò)純化質譜法（AP-MS）對27個(gè)标記的(de)病毒蛋白（26種新冠病毒蛋白和(hé / huò)1種突變體蛋白）進行分析，基于(yú)蛋白質之(zhī)間的(de)相互作用，确定新冠蛋白與人(rén)類蛋白質的(de)作用關系，并鑒定了(le／liǎo)332種高置信度新冠蛋白-人(rén)類蛋白相互作用網絡（圖2）。

圖2. SARS-CoV-2蛋白-蛋白相互作用網絡。26種SARS-CoV-2蛋白(紅色菱形)與人(rén)類蛋白(圓形;藥物靶點:橙色;蛋白複合物:黃色;同一(yī / yì ／yí)生物過程中的(de)蛋白質:藍色)之(zhī)間332種具有高置信度的(de)相互作用。

爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)進一(yī / yì ／yí)步驗證互作蛋白，研究團隊研究了(le／liǎo)人(rén)類相互作用蛋白的(de)生物學功能、解剖表達模式、SARS-CoV-2感染期間的(de)表達變化以(yǐ)及與宿主-病原體相互作用蛋白的(de)其他(tā)圖譜。科學家發現這(zhè)些新冠病毒蛋白參與基因調控、信号轉導、應激反應等多個(gè)關鍵細胞進程。約40%蛋白互作蛋白與内室或者囊泡運輸途徑有關。其中新冠病毒會對多條先天免疫系統通路如幹擾素通路和(hé / huò) NF-κB通路等産生負面影響。此外，兩個(gè)調節抗病毒先天免疫信号通路的(de)人(rén)類蛋白，也(yě)會被新冠病毒蛋白所靶向和(hé / huò)針對。

主要(yào / yāo)發現2

篩選幹預蛋白相互作用網絡的(de)現有藥物

通過研究蛋白互作，科學家找到(dào)了(le／liǎo)這(zhè)些潛在(zài)的(de)藥物靶點。通過整理這(zhè)些會與新冠蛋白相互作用的(de)蛋白信息，科學家們對比FDA的(de)數據，在(zài)已經批準的(de)藥物、正在(zài)臨床試驗的(de)藥物、以(yǐ)及尚未進入臨床試驗的(de)化合物中，找到(dào)了(le／liǎo)69個(gè)能夠選擇性幹擾新冠蛋白與人(rén)類蛋白相互作用的(de)化合物（圖3）。在(zài)這(zhè)69種化合物中，27種爲(wéi / wèi)已經通過FDA批準上(shàng)市的(de)藥物，另外還有14種藥物目前還處于(yú)臨床研究階段，剩餘28種還未進入臨床研究。

圖3. 藥物和(hé / huò)人(rén)類靶點的(de)網絡。圖中顯示了(le／liǎo)SARS-CoV-2毒餌與已批準藥物(綠色)、臨床候選藥物(橙色)和(hé / huò)臨床前候選藥物(紫色)的(de)蛋白-蛋白相互作用，以(yǐ)及針對宿主蛋白(白色背景)或已知宿主因子(zǐ)(灰色背景)的(de)實驗活動。

是(shì)否這(zhè)69種化合物都具有抗病毒活性呢？爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)在(zài)體外測試這(zhè)些藥物，他(tā)們在(zài)紐約和(hé / huò)巴黎做了(le／liǎo)病毒感染性實驗（圖4）。在(zài)紐約西奈山醫院，他(tā)們開發了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)種中通量免疫熒光技術分析(檢測病毒NP蛋白)篩選37種化合物，研究Vero E6細胞系SARS-CoV-2感染的(de)抑制作用；在(zài)法國(guó)的(de)巴斯德研究所，另一(yī / yì ／yí)批科學家通過PCR (RT-qPCR)檢測44種藥物和(hé / huò)化合物。這(zhè)兩個(gè)實驗發現了(le／liǎo)兩類分子(zǐ)能減少病毒的(de)感染性：mRNA 翻譯抑制劑和(hé / huò) Sigma1 和(hé / huò) Sigma2 受體的(de)預測調節因子(zǐ)。後續研究表明，這(zhè)些分子(zǐ)作用于(yú)病毒入侵細胞之(zhī)前，可以(yǐ)起到(dào)阻斷病毒感染的(de)作用。

圖4. 病毒感染性試驗示意圖。

爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)理解這(zhè)些抑制劑發揮抗病毒作用的(de)機制，科學家進行了(le／liǎo)時(shí)間過程實驗，在(zài)感染前或感染後不(bù)同時(shí)間添加藥物。結果顯示（圖5）PB28、佐他(tā)替芬 (Zotatifin) 和(hé / huò)羟基氯喹均降低了(le／liǎo)病毒的(de)檢出(chū)，此外，這(zhè)三種分子(zǐ)在(zài)病毒侵入後的(de)感染後4小時(shí)内均能抑制NP的(de)表達。因此，這(zhè)些分子(zǐ)似乎在(zài)病毒複制過程中發揮其抗病毒作用。

圖5. 感染前後添加藥物的(de)抗病毒作用區别。在(zài)添加高滴度病毒(MOI = 2)之(zhī)前或之(zhī)後添加藥物，抗病毒效果相似。

在(zài)本研究中，KingFisher Flex幫助研究人(rén)員解決了(le／liǎo)以(yǐ)下問題：

1. 純化的(de)均一(yī / yì ／yí)性。96通量蛋白樣本在(zài)親和(hé / huò)純化時(shí)在(zài)同一(yī / yì ／yí)條件下完成，實驗更嚴謹。

2. 提高實驗效率。AP-MS實驗涉及大(dà)量的(de)标簽蛋白純化，全自動純化系統KingFisher Flex代替手工操作，節約時(shí)間，可重複性強。

3. 實驗準确性。多檔速度可調搭配高吸附磁珠，實驗過程中，盡可能多的(de)标簽蛋白被純化出(chū)來(lái)，提高藥物靶點研究的(de)準确性。

參考文獻

David E. Gordon, Gwendolyn M. Jang, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 2020, 583, 459–468