近日
北京市自然科學基金
資助的(de)重點研究專題項目
“超高分辨冷凍電子(zǐ)顯微鏡
成像方法研究與應用”
在(zài)該項目支持下，北京大(dà)學毛有東教授團隊于(yú)2022年4月27日在(zài)國(guó)際學術期刊Nature雜志在(zài)線發表了(le／liǎo)題爲(wéi / wèi)“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的(de)研究論文，闡明了(le／liǎo)原子(zǐ)水平人(rén)源蛋白酶體動力學調控和(hé / huò)構象重編程機制，并在(zài)國(guó)際上(shàng)展示了(le／liǎo)人(rén)工智能四維重建技術用于(yú)大(dà)幅提升時(shí)間分辨冷凍電鏡分析精度。
蛋白酶體功能紊亂與人(rén)體多種疾病相關，如癌症、神經退行性疾病和(hé / huò)免疫疾病等。蛋白酶體是(shì)美國(guó)FDA批準的(de)多種治療癌症的(de)上(shàng)市小分子(zǐ)藥物的(de)直接靶标。
在(zài)正常細胞中，蛋白酶體的(de)功能受到(dào)多個(gè)水平的(de)嚴格調控。去泛素化酶USP14是(shì)主要(yào / yāo)的(de)蛋白酶體調控分子(zǐ)，被認爲(wéi / wèi)是(shì)一(yī / yì ／yí)個(gè)潛力大(dà)的(de)治療癌症和(hé / huò)神經退行性疾病的(de)重要(yào / yāo)靶标，其小分子(zǐ)抑制劑曾進入過美國(guó)一(yī / yì ／yí)期臨床研究，但圍繞USP14功能機制的(de)一(yī / yì ／yí)系列懸而(ér)未決的(de)關鍵問題限制了(le／liǎo)其靶向藥物分子(zǐ)的(de)開發和(hé / huò)臨床應用。USP14通過結合26S而(ér)被激活，然後以(yǐ)毫秒的(de)時(shí)間尺度剪切底物上(shàng)的(de)泛素鏈。它是(shì)如何被蛋白酶體激活并調控蛋白酶體功能的(de)，一(yī / yì ／yí)直是(shì)研究機構和(hé / huò)生物制藥領域期待解決的(de)關鍵科學問題。生命分子(zǐ)機器通過複雜的(de)非平衡動力學過程和(hé / huò)結構變化來(lái)實現其特殊功能，這(zhè)一(yī / yì ／yí)過程進而(ér)受到(dào)各種複雜分子(zǐ)間相互作用的(de)精準調控。如何在(zài)原子(zǐ)水平直接觀察天然态超大(dà)分子(zǐ)機器的(de)功能态動力學過程，給現有的(de)原子(zǐ)結構動态分析技術提出(chū)了(le／liǎo)挑戰。毛有東教授實驗室長期緻力于(yú)發展基于(yú)冷凍電鏡的(de)動力學重建方法，圍繞蛋白酶體、炎症小體等具有重大(dà)臨床應用前景的(de)靶點系統的(de)結構功能、動力學機制和(hé / huò)靶向調控分子(zǐ)設計深入開展交叉研究。課題組前期的(de)系列工作揭示了(le／liǎo)蛋白酶體的(de)原子(zǐ)架構、組裝原理和(hé / huò)降解泛素化底物的(de)動力學基本規律。
本研究課題進行之(zhī)初，首先要(yào / yāo)克服的(de)問題就(jiù)是(shì)“時(shí)間分辨”。蛋白酶體降解底物的(de)過程是(shì)很快的(de)，時(shí)間尺度在(zài)毫秒至秒之(zhī)間。正常條件下，想要(yào / yāo)通過冷凍電鏡技術捕獲此過程的(de)中間态結構，是(shì)非常困難的(de)。所以(yǐ)，課題組首先要(yào / yāo)讓這(zhè)個(gè)過程慢下來(lái)。通過大(dà)量的(de)條件摸索，重建反應動力學體系和(hé / huò)優化反應條件，包括優化緩沖體系、反應溫度等條件，課題組優化出(chū)較爲(wéi / wèi)可行的(de)實驗方案，從而(ér)使得時(shí)間分辨冷凍電鏡技術應用成爲(wéi / wèi)可能，獲得了(le／liǎo)含時(shí)的(de)45,193張USP14-26S複合體降解泛素底物過程中的(de)冷凍電鏡透射圖樣，挑取了(le／liǎo)3,556,806個(gè)USP14-26S-泛素底物複合體的(de)顆粒圖像。
接下來(lái)面臨的(de)極端挑戰就(jiù)是(shì)“三維分類”，冷凍電鏡捕獲的(de)複合體圖像需要(yào / yāo)經過一(yī / yì ／yí)系列的(de)分類，将它們歸爲(wéi / wèi)不(bù)同的(de)構象類别，才能呈現出(chū)蛋白反應的(de)動态過程。USP14結合到(dào)26S蛋白酶體後，使得降解底物的(de)動力學過程更加複雜，想要(yào / yāo)在(zài)如此多的(de)異構複合體顆粒圖像中，鑒别出(chū)降解過程的(de)各個(gè)時(shí)态的(de)高分辨率非平衡構象，傳統的(de)三維分類方法是(shì)無法實現的(de)。低精度的(de)三維分類将導緻低分辯的(de)三維重建，從而(ér)無法獲取原子(zǐ)水平的(de)動力學信息，無法對含時(shí)的(de)數據賦予自洽的(de)動态變化的(de)物理意義。課題組結合經過數年自主開發的(de)新型深度學習高精度三維分類和(hé / huò)四維重建方法，捕獲了(le／liǎo)USP14-26S複合體降解多泛素化底物過程的(de)13種不(bù)同功能中間狀态的(de)高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡構象，通過時(shí)間分辨冷凍電鏡分析，重建了(le／liǎo)受控蛋白酶體的(de)完整動力學工作周期，并結合分子(zǐ)生物學功能和(hé / huò)基因突變研究，闡明了(le／liǎo)USP14和(hé / huò)26S相互調控活性的(de)原子(zǐ)結構基礎和(hé / huò)非平衡動力學機制。研究發現USP14的(de)活化同時(shí)依賴于(yú)泛素識别和(hé / huò)蛋白酶體RPT1亞基的(de)結合。出(chū)人(rén)意料的(de)是(shì)，USP14通過别構效應，誘導蛋白酶體同時(shí)沿着兩條并行狀态轉變路徑發生構象變化；課題組成功捕獲到(dào)了(le／liǎo)底物降解中間狀态向底物抑制中間狀态的(de)瞬時(shí)轉化。在(zài)底物降解途徑中，USP14活化變構地(dì / de)重編程AAA-ATP酶馬達的(de)構象景觀（Conformational landscape）和(hé / huò)統計分布，并刺激20S底物通道(dào)的(de)打開，從而(ér)觀察到(dào)底物持續轉運過程的(de)ATPase六聚馬達非對稱ATP水解和(hé / huò)近乎完整的(de)全周循環周期。USP14-ATPase的(de)動态相互作用，使得ATPase馬達底物識别與26S自身的(de)去泛素化酶RPN11催化發生去耦合效應，并在(zài)26S的(de)泛素識别、底物的(de)起始易位和(hé / huò)泛素鏈回收過程中引入三個(gè)調控檢查點（動力學分岔點）。這(zhè)些發現爲(wéi / wèi)USP14調節26S的(de)完整功能周期提供了(le／liǎo)新的(de)高分辨見解，并爲(wéi / wèi)USP14靶向藥物治療發現奠定了(le／liǎo)極爲(wéi / wèi)重要(yào / yāo)的(de)機制基礎。
圖2. 通過時(shí)間分辨冷凍電鏡分析獲取的(de)USP14調控蛋白酶體底物降解的(de)并行路徑模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
這(zhè)是(shì)将人(rén)工智能四維重建技術用于(yú)提升時(shí)間分辨冷凍電鏡分析精度，針對重大(dà)疾病靶蛋白複合體，實現原子(zǐ)水平功能動力學觀測的(de)國(guó)際原創成果，展示了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)類新型的(de)蛋白質複合動力學研究範式。Nature同期在(zài)線發表了(le／liǎo)專欄推介文章，評價該成果是(shì)一(yī / yì ／yí)項重大(dà)研究，解決了(le／liǎo)原子(zǐ)水平USP14（泛素特異性肽酶14）活化和(hé / huò)其調控蛋白酶體功能的(de)機制問題。
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https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8
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