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超微量分光光度計是(shì)核酸和(hé / huò)蛋白定量的(de)常用工具,在(zài)日常使用過程中,空白測量是(shì)在(zài)樣品測量前所必須的(de)步驟。正确的(de)理解什麽是(shì)NanoPhotometer®或任何其他(tā)超微量分光光度計上(shàng)的(de)空白測量,以(yǐ)及空白讀數對工作流程和(hé / huò)結果産生的(de)影響,是(shì)保障儀器正确操作和(hé / huò)獲得可靠結果的(de)基礎。
對于(yú)雙光束紫外-可見分光光度計而(ér)言,空白與樣品測量在(zài)空間上(shàng)分開,扣除空白後得到(dào)樣品的(de)吸光值。而(ér)超微量分光光度計通常采用單光束設計,空白與樣品測量需要(yào / yāo)在(zài)時(shí)間上(shàng)分開,在(zài)進行空白測量後,得到(dào)表征光源強度的(de)基線,然後樣品的(de)測量值扣除空白測量值得到(dào)樣品的(de)吸光值。在(zài)實際測量過程中,在(zài)一(yī / yì /yí)次空白測量之(zhī)後,隻要(yào / yāo)樣品的(de)溶劑成分不(bù)變,可以(yǐ)連續地(dì / de)測量多個(gè)樣品,結果的(de)計算都基于(yú)初始空白值的(de)扣除。然而(ér),空白基線的(de)穩定是(shì)否受時(shí)間影響呢?即多久做一(yī / yì /yí)次空白,可以(yǐ)确定樣品的(de)吸光值和(hé / huò)濃度準确可靠呢?
由于(yú)超微量分光光度計通常使用氙閃燈光源,作爲(wéi / wèi)一(yī / yì /yí)種閃爍點亮的(de)冷光源,其穩定性是(shì)非常好的(de),基線的(de)穩定性通常在(zài)1小時(shí)内可保持在(zài)0.002-0.003A(10mm光程)之(zhī)内的(de)波動水平,如果将光程因子(zǐ)計算在(zài)内,相當于(yú)1-2ng/μl dsDNA的(de)濃度水平。對于(yú)常規濃度的(de)樣品而(ér)言,這(zhè)個(gè)誤差的(de)引入幾乎可以(yǐ)忽略,也(yě)不(bù)會反映在(zài)重複性之(zhī)上(shàng)。因此,對于(yú)一(yī / yì /yí)般性實驗,在(zài)起碼一(yī / yì /yí)小時(shí)内,空白測量是(shì)不(bù)用重新進行的(de)(在(zài)樣品台清潔的(de)情況下)。而(ér)對于(yú)低濃度樣品和(hé / huò)一(yī / yì /yí)些流程嚴格控制的(de)實驗而(ér)言,基線随時(shí)間的(de)波動将引入值得關注的(de)測量不(bù)确定度,可能産生可觀的(de)示值誤差,但對重複性的(de)影響較小。因此,對于(yú)一(yī / yì /yí)些特殊樣品,空白測量與樣品測量不(bù)宜間隔較長的(de)時(shí)間,以(yǐ)減小風險,甚至可能每個(gè)樣品都重新做空白。
NanoPhotometer®在(zài)每次開機時(shí)都會對光源強度進行檢測,初始化通過即代表光源已進入工作狀态。在(zài)使用過程中,也(yě)可以(yǐ)通過光譜診斷功能,實時(shí)地(dì / de)進行光源性能檢查。空白測量和(hé / huò)基線穩定性對于(yú)超微量而(ér)言是(shì)重要(yào / yāo)的(de),不(bù)少日常使用中出(chū)現的(de)問題都源自于(yú)空白和(hé / huò)基線漂移。除了(le/liǎo)設備自身的(de)診斷功能之(zhī)外,定期的(de)進行設備的(de)基線穩定性檢查也(yě)有助于(yú)判斷和(hé / huò)基線有關的(de)部件是(shì)否正常,如光源、光學路徑和(hé / huò)檢測器。
Implen通過樣品壓縮法實現了(le/liǎo)測量時(shí)間的(de)大(dà)幅縮短,使光源的(de)壽命延長至10年以(yǐ)上(shàng),在(zài)這(zhè)個(gè)基礎上(shàng),進一(yī / yì /yí)步增強了(le/liǎo)光線的(de)強度控制和(hé / huò)穩定性。而(ér)出(chū)色的(de)光學路徑設計和(hé / huò)高性能通光材料的(de)使用,也(yě)确定了(le/liǎo)基線波動在(zài)很小的(de)範圍内。在(zài)實際使用過程中,用戶根據樣品的(de)實際情況和(hé / huò)實驗允差要(yào / yāo)求,制定合理的(de)空白測量頻率,可在(zài)确定可靠性的(de)同時(shí)提高實驗效率。