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來(lái)源：賽默飛電子(zǐ)商務平台
01
目标模闆濃度太低
在(zài)qPCR 中體現爲(wéi / wèi)CT值偏大(dà)，複孔重複性不(bù)佳。
可能的(de)原因1
基因表達豐度低
優化建議：選擇高靈敏度、熒光信号強、更寬動态範圍的(de)qPCR試劑對付低豐度模闆；
可能的(de)原因2
模闆稀釋過度
優化建議：提高模闆濃度(濃縮)，減少模闆稀釋度（理論上(shàng)每稀釋10倍，CT 值大(dà) 3.3）；
可能的(de)原因3
模闆有降解
優化建議：重新制備模闆，注意選擇好的(de)RNA純化Kit，避免RNA降解，優化逆轉錄條件。
02
擴增效率異常
擴增效率偏離100%±10% 應考慮優化。Ct值出(chū)現太晚的(de)潛在(zài)原因之(zhī)一(yī / yì ／yí)是(shì)擴增效率低，導緻效率低的(de)原因可能有
可能的(de)原因1
反應條件未優化
優化建議：可以(yǐ)在(zài)同一(yī / yì ／yí)實驗中預設不(bù)同退火溫度，選擇Ct值較小且平台期熒光強度高的(de)那個(gè)溫度；
可能的(de)原因2
存在(zài)PCR反應抑制劑
優化建議：一(yī / yì ／yí)般反應抑制劑多爲(wéi / wèi)模闆帶入，可考慮重新制備模闆或者稀釋模闆從而(ér)降低抑制劑水平；選擇反應性能強健、更耐受抑制劑 的(de)試劑有助于(yú)減少此類因素影響；
可能的(de)原因3
模闆擴增區域有複雜二級結構，高GC含量，影響擴增效率
優化建議：同一(yī / yì ／yí)目标設計多個(gè)擴增區域/避開二級結構複雜的(de)區域；選擇性能強健耐受性高的(de)預混液，都是(shì)可行的(de)解決方法。
03
PCR産物過長影響擴增效率
優化建議：
縮短PCR産物長度，控制在(zài)100 bp-150 bp之(zhī)内
優化建議：
嘗試标準的(de)三步擴增提高擴增效率
優化建議：
加長延伸時(shí)間使得反應完全，以(yǐ)提高擴增産量
04
無Ct值
可能的(de)原因1
循環數不(bù)夠
優化建議：一(yī / yì ／yí)般反應設置爲(wéi / wèi)40個(gè)，必要(yào / yāo)時(shí)可增加到(dào)45個(gè)循環；
可能的(de)原因2
信号采集設置不(bù)當
優化建議：兩步擴增一(yī / yì ／yí)般将信号采集設置在(zài)退火延伸階段，三步擴增程序應當将信号采集設置在(zài)72℃延伸階段。探針法通常在(zài)退火結束時(shí)或延伸結束時(shí)采集信号。
01
樣本重複性差
優化建議：
取材部位/處理方式/時(shí)間應嚴謹地(dì / de)保障一(yī / yì ／yí)緻；選擇穩定可靠的(de)試劑盒進行樣本制備（如RNA純化盡量選離心柱，帶去除gDNA的(de)）、提取後對RNA的(de)完整度和(hé / huò)純度進行檢驗，減少樣本質量重複性差。
02
技術重複性差
分爲(wéi / wèi)複孔重複性差（複孔之(zhī)間ΔCt<0.5就(jiù)算重複性良好），不(bù)同次跑的(de)闆間重複性差。
排查方向有以(yǐ)下——
1
模闆濃度低容易出(chū)現複孔重複性差，若同時(shí)Ct值偏大(dà)，可嘗試提高模闆量。條件允許的(de)話，增加複孔數，棄掉偏差大(dà)的(de)值也(yě)好辦法。
2
加樣誤差是(shì)同時(shí)影響孔間和(hé / huò)闆間重複性的(de)常見原因。良好的(de)操作習慣有助于(yú)提高實驗重複性，包括：定期校準加樣器能減少不(bù)同時(shí)期之(zhī)間的(de)加樣體積偏差；選擇預混液能減少加樣誤差影響孔間重複性；低吸附耗材能減少試劑挂壁；穩定的(de)操作環境溫度，反應前充分混勻樣品和(hé / huò)試劑和(hé / huò)離心除氣泡避免影響讀數，都有助于(yú)減少孔間差異和(hé / huò)闆間差異。注意儀器上(shàng)不(bù)同位置的(de)孔溫度一(yī / yì ／yí)緻性也(yě)可能影響孔間一(yī / yì ／yí)緻性。
3
試劑的(de)配液穩定性也(yě)值得重視。有時(shí)候，配置好的(de)反應闆不(bù)一(yī / yì ／yí)定能馬上(shàng)上(shàng)機，等待時(shí)長難以(yǐ)确定，導緻闆間誤差過大(dà)——若預混液能保持足夠長時(shí)間的(de)穩定性，可确定第一(yī / yì ／yí)個(gè)檢測闆的(de)結果與一(yī / yì ／yí)個(gè)檢測闆的(de)結果相匹配，同時(shí)還能提高工作流程的(de)整體便利性。
4
試劑的(de)批間一(yī / yì ／yí)緻性是(shì)影響重複性、實驗前後可比較性的(de)重要(yào / yāo)因素。定量PCR反應體積很小且靈敏度高，不(bù)同批次試劑的(de)痕量偏差都可能影響結果穩定。盡量選擇同一(yī / yì ／yí)批次/批号的(de)試劑，選擇信譽可靠、批間一(yī / yì ／yí)緻性高的(de)産品，有助于(yú)提高實驗重複性和(hé / huò)結果可比較性。
用SYBR Green可以(yǐ)通過測熔解曲線來(lái)分析确認反應産物特異性，熔解曲線是(shì)随溫度升高DNA雙螺旋結構解開程度的(de)曲線：單尖峰提示産物隻有一(yī / yì ／yí)種；多峰則提示有不(bù)止一(yī / yì ／yí)個(gè)産物，比如引物二聚體或者非特異擴增。
排查方向有以(yǐ)下——
02
非特異擴增
排查特征：
電泳檢測；雜峰Tm值在(zài)80℃之(zhī)後，目标峰之(zhī)後的(de)多爲(wéi / wèi)非特異擴增；
優化建議：
引物設計特異性不(bù)好或者模闆質量不(bù)佳（如含有基因組污染）都可能導緻非特異擴增
——建議考慮重新設計引物或者重新制備模闆（記得在(zài)RNA純化中用DNase處理降解gDNA）
另外，非特異擴增也(yě)可能來(lái)自反應退火開始前各種非特異延伸，和(hé / huò)“實驗室某個(gè)角落or空氣中的(de)前任、前前任qPCR” DNA污染！帶有UDG和(hé / huò)dUTP配方設計的(de)預混液可一(yī / yì ／yí)步消除掉這(zhè)類非特異産物；再加上(shàng)抗體暫時(shí)封閉酶活的(de)熱啓動設計，既能防止退火前的(de)非特異反應，又能在(zài)退火同時(shí)迅速釋放酶活，讓反應更快速高效率。
Tips:
1
熔解曲線不(bù)理想還可嘗試兩步法，因爲(wéi / wèi)二步法擴增特異性高。
2
單峰Tm值在(zài)80℃之(zhī)前考慮沒有模闆的(de)可能性
3
單峰不(bù)尖要(yào / yāo)考慮可能有大(dà)小接近的(de)非特異擴增
4
Mg2+離子(zǐ)濃度超過3mM以(yǐ)上(shàng)則易形成引物二聚體，選擇一(yī / yì ／yí)管全包條件已優化的(de)預混液就(jiù)不(bù)用考慮
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A
兼顧高靈敏度和(hé / huò)高特異性：
保障檢測的(de)特異性同時(shí)具有更小的(de)Ct 值，低檢出(chū)限5拷貝
B
高強度熒光信号：
更大(dà)的(de)擴增曲線dRn值，更高的(de)平台期熒光信号
C
寬動态範圍：
可在(zài)跨6個(gè)對數級動态範圍内進行精準檢測，并确定可靠的(de)線性
D
桌面穩定性高：
配置好的(de)qPCR反應體系可以(yǐ)在(zài)室溫下穩定保存72小時(shí)
E
批間一(yī / yì ／yí)緻性高：
生産過程遵循ISO 9001質量管理體系，保障數據的(de)穩定性和(hé / huò)重複性
F
抗殘留污染：
采用UDG和(hé / huò)dUTP配方，杜絕殘留擴增産物污染造成的(de)假陽性結果
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