01

OD600的(de)應用--幫助了(le／liǎo)解細菌的(de)生長狀态

OD600是(shì)指在(zài)600nm波長處的(de)吸光值，常常被用于(yú)分析細菌生長和(hé / huò)進行抗生素敏感性測試，在(zài)細菌檢測中，測量波長需要(yào / yāo)選擇在(zài)生物材料吸光度最小的(de)範圍内。因此，這(zhè)些細菌生長曲線測量通常使用600-670nm左右的(de)紅色波長。在(zài)細菌連續培養過程中，在(zài)不(bù)同的(de)時(shí)間點檢測菌液的(de)OD600值，然後以(yǐ)時(shí)間爲(wéi / wèi)橫坐标，OD600爲(wéi / wèi)縱坐标，描繪細菌的(de)生長曲線。結合生長曲線，可以(yǐ)評估細菌所處的(de)生長階段，進而(ér)可以(yǐ)确定合适的(de)誘導表達或收獲的(de)時(shí)間點。

02

OD600 測量菌液/細胞濃度的(de)原理

細菌密度的(de)測量方式是(shì)通過光的(de)散射，也(yě)就(jiù)是(shì)看渾濁程度而(ér)不(bù)是(shì)吸光度，光的(de)散射程度反應的(de)是(shì)細胞的(de)生物質量而(ér)不(bù)是(shì)細胞個(gè)數，也(yě)稱濁度測量。濁度法測量非均質溶液中是(shì)否存在(zài)固體顆粒。固體顆粒可以(yǐ)是(shì)細胞、沉澱、聚集體或溶液中存在(zài)的(de)任何其他(tā)固體物質。顆粒會散射光束中的(de)光子(zǐ)，因此儀器檢測器會檢測到(dào)較低的(de)光強度。這(zhè)種現象與吸光度測量截然不(bù)同，吸光度測量是(shì)指光子(zǐ)被均勻溶液中的(de)特定染料吸收，吸光度和(hé / huò)濁度散射的(de)基本區别如圖 1 所示。

圖1：吸光度和(hé / huò)濁度散射的(de)基本區别, 在(zài)吸光度測定中，由于(yú)光被樣品吸收，光電探測器中的(de)光強會減弱（A）；在(zài)濁度測定中，入射光由樣本中的(de)細胞/粒子(zǐ)随機産生散射。這(zhè)将導緻方向的(de)不(bù)确定性。繼續沿直線傳播的(de)光會進入檢測器，光強也(yě)會減弱（B）

03

使用不(bù)同的(de)設備測量OD600細菌濃度可能得到(dào)不(bù)同的(de)數值

對于(yú)具有濁度的(de)樣品，如細菌溶液、細胞培養物，測量的(de)“吸光值”是(shì)由于(yú)光散射，而(ér)不(bù)是(shì)溶質分子(zǐ)光吸收的(de)結果。由于(yú)光散射的(de)程度受系統光學特性(比色池和(hé / huò)儀器出(chū)口狹縫之(zhī)間的(de)距離、單色器光學特性、狹縫幾何特性等)的(de)影響，使用不(bù)同類型的(de)分光光度計測量同一(yī / yì ／yí)樣品時(shí)，可能會得到(dào)不(bù)同的(de)OD600讀數。

那我們來(lái)看下主要(yào / yāo)有哪些原因影響濁度的(de)測量呢？

一(yī / yì ／yí)是(shì)濁度測量受樣品中顆粒濃度的(de)影響

濁度測量總是(shì)在(zài)異質樣品中進行，一(yī / yì ／yí)般需要(yào / yāo)測量96/ 384 孔闆，現在(zài)多數酶标儀通常使用相當窄的(de)測量光束。通常情況下，微孔闆光度計的(de)光束直徑不(bù)到(dào)一(yī / yì ／yí)毫米，當光束穿過96孔闆的(de)孔時(shí)，測量光束隻能覆蓋樣品體積的(de)很小一(yī / yì ／yí)部分（圖2）。另外，現代微孔闆光度計的(de)采樣時(shí)間也(yě)很短，通常爲(wéi / wèi)毫秒級，這(zhè)些對于(yú)濁度測量來(lái)說(shuō)并不(bù)是(shì)最佳選擇會增加變化。比如液體中的(de)固體顆粒并非處于(yú)靜止狀态，而(ér)是(shì)在(zài)整個(gè)液體中自由漂浮。因此，當樣品中隻有少量固體顆粒時(shí)，在(zài)重複測量中，相同數量的(de)顆粒出(chū)現在(zài)光束内的(de)概率很低。如果樣品中有100 個(gè)顆粒，那麽測量光束區域内的(de)顆粒數最有可能是(shì)1個(gè)，但随機情況下可能是(shì)0個(gè)或2個(gè)，甚至3個(gè)。當采樣時(shí)間也(yě)以(yǐ)毫秒爲(wéi / wèi)單位時(shí)，液體中顆粒的(de)動态流動不(bù)會明顯改變單個(gè)測量中的(de)這(zhè)種情況。因此,當OD值較低時(shí)，檢測精度可能會明顯降低，吸光度檢測的(de) CVs% 也(yě)會大(dà)于(yú)正常值。

同樣，當樣品中的(de)顆粒數量增加到(dào)非常多時(shí)，從顆粒上(shàng)散射的(de)光子(zǐ)會撞擊到(dào)另一(yī / yì ／yí)個(gè)顆粒并重新散射。這(zhè)将導緻一(yī / yì ／yí)些散射光子(zǐ)經過多次散射後到(dào)達檢測器。因此，濁度測量的(de)線性測量範圍總是(shì)低于(yú)吸光度測量。

二是(shì)不(bù)同儀器分光光度計的(de)設計影響濁度測量

吸光度和(hé / huò)濁度測量之(zhī)間第二個(gè)非常重要(yào / yāo)的(de)區别是(shì)，不(bù)同儀器的(de)光學設計會影響所得到(dào)的(de)OD值（圖 3）。因此，不(bù)同廠家生産的(de)微孔闆光度計沒法對同一(yī / yì ／yí)樣品給出(chū)相同的(de)OD值。這(zhè)裏有兩個(gè)影響因素：一(yī / yì ／yí)是(shì)光電探測器收集窗口的(de)大(dà)小，二是(shì)收集狹縫的(de)大(dà)小。探測器窗口越大(dà)，收集到(dào)的(de)輕微散射光子(zǐ)就(jiù)越多，因此觀測到(dào)的(de)OD 值就(jiù)越低。還有一(yī / yì ／yí)個(gè)主要(yào / yāo)問題是(shì)樣品到(dào)檢測器的(de)距離。如果檢測器距離樣品很遠，即使是(shì)輕微散射光子(zǐ)也(yě)會到(dào)達檢測器；如果很近，即使是(shì)強烈散射光子(zǐ)也(yě)會被檢測器收集到(dào)。因此，這(zhè)個(gè)距離對得出(chū)的(de)OD 值影響也(yě)很大(dà)。由于(yú)每個(gè)制造商的(de)光學設計不(bù)同，這(zhè)兩個(gè)參數（距離和(hé / huò)探測器的(de)大(dà)小）在(zài)兩台不(bù)同的(de)儀器中永遠不(bù)會相同。這(zhè)些因素不(bù)會影響吸收測定，因爲(wéi / wèi)在(zài)吸收測定中光束形狀保持不(bù)變。檢測器的(de)大(dà)小或距離不(bù)會改變到(dào)達檢測器的(de)光量。

圖示3：檢測器收集窗口的(de)大(dà)小和(hé / huò)與樣品的(de)距離都會改變所測得的(de)OD值，因此不(bù)同的(de)儀器會對相同的(de)樣品給出(chū)不(bù)同的(de)OD值。檢測到(dào)的(de)OD值差異很容易達到(dào)20-40%。

比如下圖中，在(zài)濁度測定結果的(de)偏差表明，Multiskan Sky 和(hé / huò) SkyHigh 采用了(le／liǎo)非常相似的(de)光學設計，因此結果幾乎相同，但Varioskan LUX 和(hé / huò) Multiskan FC 采用了(le／liǎo)不(bù)同類型的(de)光學器件，因此與Sky和(hé / huò)SkyHigh有很大(dà)不(bù)同，兩者之(zhī)間也(yě)存在(zài)明顯差異。但在(zài)吸光度測量方面，所有四款酶标儀的(de)測量結果完全相同。

圖示4：不(bù)同型号酶标儀檢測吸光度和(hé / huò)濁度的(de)比較

因此，對于(yú)OD600測量，不(bù)同酶标儀的(de)結果不(bù)能直接進行比較。對于(yú)OD600測量，使用相同型号的(de)分光光度計可以(yǐ)保障良好的(de)重複結果。而(ér)對于(yú)不(bù)同酶标儀的(de)結果首先需要(yào / yāo)使用适當的(de)校準曲線進行标準化。

常規的(de)酶标儀檢測都具備了(le／liǎo)光吸收檢測功能，賽默飛多款酶标儀具有單獨模塊用于(yú)濁度檢測，比如單功能酶标儀FC，配有比色杯模塊的(de)Multiskan SkyHigh 以(yǐ)及多功能酶标儀Varioskan LUX等，都是(shì)核酸、蛋白質、菌液濃度及其他(tā)物質測量的(de)多功能儀器，可爲(wéi / wèi)用戶提供完善的(de)解決方案。