近日，中國(guó)農業科學院哈爾濱獸醫研究所王曉鈞團隊在(zài)《PLoS Pathogens》雜志刊載了(le／liǎo)題爲(wéi / wèi) 「Selective usage of ANP32 proteins by influenza B virus polymerase: Implications in determination of host range」的(de)文章。該文章系統性地(dì / de)揭示了(le／liǎo) B 型流感病毒感染的(de)種間限制機制，發現宿主 ANP32A&B 蛋白是(shì)決定 B 型流感病毒聚合酶活性的(de)須關鍵因子(zǐ)。

甲型流感病毒（IAV）和(hé / huò)乙型流感病毒（IBV）屬于(yú)正粘病毒科。禽類作爲(wéi / wèi) IAV 的(de)重要(yào / yāo)宿主，經常将 IAV 跨物種傳播給哺乳動物。而(ér) IBV 與 IAV 複制機制類似且受體相同，卻少有禽類自然感染 IBV 的(de)報道(dào)，這(zhè)說(shuō)明 IBV 在(zài)禽類體内無法複制，但具體機制尚不(bù)明确。

圖 2   乙型流感病毒結構示意圖

前期研究已經證明，宿主 ANP32A&B 蛋白在(zài)  IAV 聚合酶活性中起到(dào)關鍵性作用，那麽 ANP32 蛋白是(shì)否在(zài) IBV 的(de)複制中也(yě)具有類似的(de)功能呢？不(bù)同物種的(de) ANP32 蛋白是(shì)否爲(wéi / wèi) IBV 提供不(bù)同的(de)支持？

研究團隊構建出(chū)不(bù)同的(de)細胞系，利用聚合酶雙熒光報告系統等技術，獲得重大(dà)發現，其中兩點尤爲(wéi / wèi)突出(chū)：

1.ANP32A、ANP32B 對于(yú) IBV 的(de)複制起主要(yào / yāo)作用，ANP32E 的(de)作用相對有限；

2.哺乳動物 ANP32A&B 蛋白可以(yǐ)完全支持 IBV 聚合酶複制，而(ér)禽類 ANP32A 由于(yú)有 33 個(gè)氨基酸的(de)插入以(yǐ)及禽類 ANP32B 由于(yú) 129/130 位點的(de)突變，導緻禽類 ANP32A&B 均無法支持 IBV 的(de)複制。

爲(wéi / wèi)進一(yī / yì ／yí)步探索不(bù)同物種 ANP32 蛋白支持 IBV 聚合酶活性差異的(de)分子(zǐ)機制，該研究利用 Co-IP，以(yǐ)及基于(yú) Biacore 的(de)表面等離子(zǐ)共振 SPR 等技術進行相關檢測。

Co-IP 實驗結果顯示： huANP32A 和(hé / huò)  chANP32A 對于(yú) IBV 聚合酶具有相似的(de)結合能力，但無法給出(chū)定量的(de)結合差異分析。爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)解決這(zhè)個(gè)問題，研究人(rén)員使用 Biacore  對 IBV 聚合酶與 ANP32 蛋白進行動力學/親和(hé / huò)力表征。

研究人(rén)員使用 CM5 芯片氨基偶聯 Anti-His 抗體自制 Anti-His 捕獲芯片，随後流經含有 His-IBV 聚合酶的(de)細胞裂解液，捕獲 His-IBV 聚合酶。然後将 ANP32 蛋白稀釋到(dào)一(yī / yì ／yí)系列濃度作爲(wéi / wèi)流動相，使用 Biacore T200 對聚合酶與 ANP32 蛋白進行動力學/親和(hé / huò)力表征。

實驗結果表明：與 Co-IP 結果一(yī / yì ／yí)緻，huANP32A，chANP32A 和(hé / huò) huANP32A + 33 在(zài) 0.15625-5μM 的(de)濃度下均能與病毒聚合酶結合（圖 4A – 4C）。相反，huANP32A_165T 幾乎不(bù)與聚合酶結合（圖 4D）。在(zài)另一(yī / yì ／yí)個(gè)僅将兩個(gè)聚合酶亞基（PA 和(hé / huò) PB1）固定在(zài) CM5 芯片上(shàng)的(de)對照實驗中，在(zài) huANP32A 和(hé / huò)病毒聚合酶亞基之(zhī)間未檢測到(dào)特異性親和(hé / huò)力（圖 4E）。

通過 Biacore 分析計算得出(chū) huANP32A，chANP32A 和(hé / huò) huANP32A+ 33 的(de)解離平衡常數（KD）有着顯著差異。huANP32A 與 IBV 聚合酶結合，KD = 0.05418μM，幾乎比 chANP32A 低 3 倍。插入 33 個(gè)氨基酸的(de) huANP32A 和(hé / huò)聚合酶結合的(de) KD 值也(yě)從 0.05418μM 增加到(dào) 0.1013μM（圖 4F）。盡管 huANP32A，chANP32A 和(hé / huò) huANP32A + 33 具有相似的(de)解離速率常數（kd），但結合速率常數（ka）卻截然不(bù)同。huANP32A 與 His-IBV 聚合酶結合的(de) ka 值是(shì)其他(tā)兩種蛋白質的(de) ka 值的(de)兩倍。

該結果表明，與 ChANP32A 相比，huANP32A 對 IBV 聚合酶具有更強的(de)結合親和(hé / huò)力，并且 33 個(gè)氨基酸的(de)插入降低了(le／liǎo) ANP32A 與 IBV 聚合酶的(de)結合親和(hé / huò)力。

圖 4 IVB 聚合酶與 ANP32 蛋白互作 Biacore 結果

該研究揭示了(le／liǎo)哺乳動物 ANP32 家族蛋白是(shì)支持 IBV 複制的(de)關鍵宿主蛋白，并明确了(le／liǎo)禽類 ANP32 蛋白無法支持病毒聚合酶活性的(de)分子(zǐ)機制（圖 5）。對理解 IBV 聚合酶功能、作用機理和(hé / huò)宿主範圍決定因素具有重要(yào / yāo)意義，同時(shí)可爲(wéi / wèi)抗 IBV 藥物靶點設計和(hé / huò)跨物種傳播的(de)防控提供理論依據。

圖 5 IAV 和(hé / huò) IBV 聚合酶對 ANP32 蛋白的(de)選擇性使用及其分子(zǐ)基礎

縱觀全文，Biacore 的(de)技術優勢清晰易見

1、Biacore 區分出(chū)不(bù)同物種、不(bù)同氨基酸結構的(de)同源蛋白與 IBV 聚合酶相互作用的(de)細微差異，這(zhè)是(shì) Co-IP 等同類技術所不(bù)具備的(de)，充分體現出(chū) Biacore的(de)分辨率。

2、Biacore 互作信息，幫助研究人(rén)員從 KD、ka、kd 等方向表征分子(zǐ)相互作用，定量地(dì / de)闡釋不(bù)同分子(zǐ)之(zhī)間相互作用的(de)異同點，從而(ér)幫助科研人(rén)員好的(de)闡明相關的(de)分子(zǐ)機制。

3、利用 Biacore 可以(yǐ)直接捕獲粗樣品中的(de)目的(de)蛋白，并進行親和(hé / huò)力動力學的(de)表征。這(zhè)這(zhè)篇文章中，研究人(rén)員利用 Anti-His 捕獲芯片，能夠從細胞裂解液中直接捕獲 His-IBV 聚合酶，并檢測其與 ANP32 蛋白的(de)互作。這(zhè)樣隻需要(yào / yāo)純化一(yī / yì ／yí)種蛋白即可進行的(de)親和(hé / huò)力動力學表征，降低了(le／liǎo)樣品準備時(shí)間與難度。

自 1990 年上(shàng)市自今，Biacore 經過 30 年的(de)發展，已經成爲(wéi / wèi)分子(zǐ)互作檢測的(de)「金标準」，廣泛應用到(dào)基礎科研與藥物開發的(de)多個(gè)領域，累計發表的(de)文章已經過四萬篇，過 80% 的(de)上(shàng)市抗體藥物在(zài)研發、申報與生産中都使用了(le／liǎo) Biacore。