爲(wéi / wèi)何要(yào / yāo)檢測内毒素 圖片

爲(wéi / wèi)内毒素無處不(bù)在(zài)

内毒素又稱爲(wéi / wèi)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，分子(zǐ)量範圍爲(wéi / wèi)3,000至4,000Da，由長鏈複合多糖尾部和(hé / huò)疏水脂質基團組成（圖1）），是(shì)大(dà)多數格蘭氏陰性菌細胞壁的(de)組成部分，具有較高的(de)熱穩定性。當細菌在(zài)活躍生長或在(zài)死亡分解時(shí)，細胞壁中的(de)脂多糖就(jiù)被釋放到(dào)周圍環境中。

圖1.脂多糖結構。内毒素爲(wéi / wèi)複合脂多糖，是(shì)革蘭氏陰性細菌細胞壁的(de)活性結構成分。它們由核心寡糖鏈、O-特異性多糖側鏈（O-抗原）和(hé / huò)脂質組分（脂質A）組成。

使用如大(dà)腸杆菌(E.coli)生産的(de)重組蛋白，或者提取革蘭氏陰性菌内的(de)核酸時(shí)經常遇到(dào)内毒素污染問題。内毒素污染的(de)蛋白質/抗體/核酸在(zài)轉染入細胞中或者注入到(dào)動物體内時(shí)，可引發強烈的(de)免疫反應，導緻全身性炎症反應綜合征（SIRS）和(hé / huò)/或敗血症。因此，内毒素的(de)去除對于(yú)人(rén)類疾病治療的(de)注射型藥品、生物制品等都是(shì)必須的(de)，尤其對于(yú)基因藥物、蛋白藥物、抗體藥物、疫苗等生物制品的(de)下遊純化處理來(lái)說(shuō)就(jiù)顯得非常重要(yào / yāo)。

中國(guó)藥典的(de)規定

細菌内毒素檢查法（通則 1143）包括兩種方法：凝膠法和(hé / huò)光度測定法，後者又包括濁度法和(hé / huò)顯色法，可以(yǐ)選用其中任何一(yī / yì ／yí)種方法進行細菌内毒素檢查。凝膠法和(hé / huò)光度法各具優點和(hé / huò)局限：

凝膠法

凝膠法的(de)優點是(shì)操作簡便，供試品在(zài)排除幹擾作用後均可使用凝膠法進行檢驗。

凝膠法的(de)幹擾試驗是(shì)确定供試品能否使用凝膠法的(de)決定因素。進行幹擾實驗時(shí)，應挑選與鲎試劑反應呈陰性的(de)樣品進行幹擾試驗。若樣品稀釋到(dào) MVD(有效稀釋倍數) 仍不(bù)能排除幹擾作用，應進一(yī / yì ／yí)步對供試品的(de)前處理進行研究，再用幹擾試驗驗證能否使用凝膠法。

光度法

光度法（包括濁度法和(hé / huò)顯色法）可定量檢測内毒素的(de)含量，能較爲(wéi / wèi)準确評估産品在(zài)生産過程中污染的(de)相對風險，定量檢測的(de)數據不(bù)僅有利于(yú)追蹤産品質量趨勢，還能起到(dào)風險預警的(de)作用，更易達到(dào)數據完整性的(de)要(yào / yāo)求。

由于(yú)光度法的(de)檢測限範圍比凝膠法寬，使得有幹擾的(de)樣品可以(yǐ)有更大(dà)的(de)稀釋倍數，對于(yú)部分使用凝膠法無法排除幹擾的(de)樣品，可以(yǐ)嘗試使用光度法建立細菌内毒素檢測方法。

常用實驗方法和(hé / huò)幹擾分析

鲎試劑是(shì)從海洋動物鲎提取的(de)血細胞溶解物,是(shì)檢測革蘭氏陰性細菌内毒素的(de)一(yī / yì ／yí)種敏感試劑。其實驗原理如圖2所示：

圖2.鲎試劑的(de)級聯反應。LPS（内毒素）激活質膜結合因子(zǐ)C。活化的(de)因子(zǐ)C激活因子(zǐ)B，活化的(de)因子(zǐ)B激活凝固酶原，生成凝血酶。加入顯色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA後，活化的(de)蛋白酶-凝血酶催化對硝基苯胺（pNA）的(de)釋放，産生黃色。通過測量405nm處吸光度值進行定量。根據标準曲線可推算得出(chū)結果。紅色表示無活性酶，綠色表示活性酶。

通常實驗流程：

Thermo提供光度法内毒素定量試劑 (A39552）。那麽試劑的(de)品質如何？我們将從靈敏度、數據重複性、抗幹擾性等幾個(gè)角度對Pierce内毒素定量試劑盒的(de)性能進行驗證：

數據靈敏度和(hé / huò)重複性

提供兩個(gè)線性動态範圍：0.01-0.1 EU/mL和(hé / huò)0.1-1.0 EU/mL（圖3）。使用此試劑盒的(de)實驗-實驗和(hé / huò)操作者-操作者差異系數（CV）爲(wéi / wèi)3%。靈敏度高可以(yǐ)有效地(dì / de)避免内毒素定量中潛在(zài)的(de)假陰性或者假陽性。

圖3.Pierce内毒素定量試劑盒的(de)标準曲線。标準曲線顯示出(chū)優異的(de)線性度，r2= 0.99。Pierce顯色法内毒素定量試劑盒的(de)較低标準曲線範圍爲(wéi / wèi)0.01-0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL标準曲線表示使用内毒素标準品和(hé / huò)阿米巴樣細胞裂解物培養14分鍾，随後使用顯色底物培養6分鍾。對于(yú)較低濃度，使用内毒素标準品和(hé / huò)阿米巴樣細胞裂解物培養30分鍾，随後使用顯色底物培養6分鍾。低濃度标準品（0.01-0.1 EU/mL）顯示出(chū)了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)緻性和(hé / huò)再現性（n = 17；CV = 3%）。

兼容性

鲎試劑可能受許多因素影響，造成假陰性或假陽性。包括：

i. 反應溫度、樣品酸堿度、離子(zǐ)強度和(hé / huò)金屬離子(zǐ)（如鎂和(hé / huò)鈣）

ii. 血清蛋白、核酸、脂肪酸、表面活性劑和(hé / huò)螯合劑（如EDTA和(hé / huò)肝素）可引起内毒素分子(zǐ)結構的(de)變化

iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的(de)非特異性幹擾：鲎試劑會與其反應，造成假陽性結果

表1.使用Pierce顯色法内毒素定量試劑盒，獲得有效内毒素檢測結果所兼容的(de)高濃度。所列出(chū)的(de)濃度是(shì)指樣品中添加0.5 EU内毒素時(shí)，未使定量值降低的(de)實際濃度。以(yǐ)比例的(de)形式表示稀釋濃度，其中1:100表示100倍稀釋

需要(yào / yāo)指出(chū)的(de)是(shì)：Pierce顯色法内毒素定量試劑盒（貨号A39552）與β-葡聚糖兼容，并且在(zài)含有10ng/ mL（1,3）-β-D-葡聚糖的(de)樣品中，未顯示出(chū)增強作用。

内毒素去除

超濾、多粘菌素B親和(hé / huò)樹脂以(yǐ)及基于(yú)樹脂或膜的(de)色譜法是(shì)内毒素去除的(de)傳統方法，這(zhè)些方法在(zài)蛋白回收率、内毒素結合能力等方面具有局限性，有的(de)甚至本身具有毒。

Thermo Fisher Scientific提供高載量内毒素去除樹脂(88270)，是(shì)基于(yú)ε-聚賴氨酸親和(hé / huò)樹脂（天然賴氨酸的(de)聚合物），顯示出(chū)内毒素結合能力和(hé / huò)蛋白質回收率：

➤ 結合力可以(yǐ)達到(dào)2,000,000 EU/mL

➤ 在(zài)處理初始内毒素水平爲(wéi / wèi)10,000 EU/mL的(de)樣品時(shí)，去除效率可以(yǐ)達到(dào)99%以(yǐ)上(shàng)

圖4.采用Pierce高通量内毒素去除樹脂去除内毒素的(de)效率。（A）内毒素去除和(hé / huò)定量的(de)工作流程。（B）測定和(hé / huò)去除蛋白質樣品中的(de)内毒素以(yǐ)備下遊應用。