近期已經證明，細胞外囊泡 (EV) 攜帶 DNA。然而(ér)，EV中 DNA (EV-DNA) 的(de)許多基本特征仍然難以(yǐ)捉摸。
2022年4月4日，廈門大(dà)學顔曉梅團隊在(zài)Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在(zài)線發表題爲(wéi / wèi)“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的(de)研究論文，該研究通過納米流式細胞儀 (nFCM) 可以(yǐ)檢測直徑小至 40 nm 的(de)單個(gè) EV 和(hé / huò) SYTO 16 染色後 200 bp 的(de)單個(gè) DNA 片段，用于(yú)研究單個(gè)囊泡處的(de) EV-DNA。
通過同時(shí)對單個(gè)顆粒進行側向散射和(hé / huò)熒光 (FL) 檢測并結合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體相關的(de) DNA 大(dà)量存在(zài)于(yú)由細胞培養物制備的(de) EV 樣品中（超速離心培養基）；(2) 單個(gè) EVs 中 EV-DNA 的(de)數量表現出(chū)很大(dà)的(de)異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的(de)數量在(zài) 30% 到(dào) 80% 之(zhī)間變化，具體取決于(yú)細胞類型；(3) 外部 EV-DNA 主要(yào / yāo)定位在(zài)相對較小的(de) EVs 上(shàng)（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外部 DNA+ EVs 的(de)分泌可以(yǐ)通過抑制外泌體分泌途徑顯著減少；(4) 内部 EV-DNA 主要(yào / yāo)封裝在(zài)相對較大(dà)的(de) EV 的(de)管腔内（例如 HCT-15 細胞系爲(wéi / wèi) 80-200 nm）；(5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是(shì)外部和(hé / huò)内部 EV-DNA 的(de)主要(yào / yāo)形式；(6) EVs 中未發現組蛋白 (H3)，EV-DNA 與組蛋白不(bù)相關，(7) 基因毒性藥物誘導 DNA+ EVs 的(de)釋放增加，外部DNA+ EVs和(hé / huò)内部DNA+ EVs的(de)數量以(yǐ)及單個(gè)EVs中的(de)DNA含量均顯着增加。這(zhè)項研究爲(wéi / wèi)深入了(le／liǎo)解 DNA 與EV的(de)關聯提供了(le／liǎo)直接和(hé / huò)确鑿的(de)實驗證據。
細胞外囊泡 (EVs) 是(shì)由幾乎所有細胞類型分泌的(de)納米級膜囊泡，通過将蛋白質、核酸和(hé / huò)脂質從供體細胞轉移到(dào)受體細胞來(lái)介導細胞間通訊。研究表明，EV中存在(zài)基因組 DNA、線粒體 DNA 甚至病毒 DNA。通過 DNA 的(de)包裝和(hé / huò)水平轉移，EV 在(zài)維持細胞穩态、調節免疫反應和(hé / huò)調節腫瘤進展方面發揮着重要(yào / yāo)的(de)作用。
基于(yú) EV 中的(de) DNA (EV-DNA) 開發了(le／liǎo)用于(yú)腫瘤診斷的(de)液體活檢測試。盡管已經認識到(dào) EV-DNA 的(de)生物學意義，但對 EV-DNA 的(de)探索較少，許多基本特征仍存在(zài)争議，例如 DNA 是(shì)否與所有或部分 EV 亞群相關？EV-DNA 是(shì)否位于(yú)内腔和(hé / huò)/或 EV 表面？DNA含量和(hé / huò)EV大(dà)小之(zhī)間有什麽關系？EV-DNA 是(shì)單鏈 DNA (ssDNA) 還是(shì)雙鏈 DNA (dsDNA)？對 EV-DNA 的(de)研究通常通過從 EV 分離物中提取 DNA，然後進行豐度、片段長度和(hé / huò)序列評估來(lái)進行。通過将 DNase 酶消化與 Fragment Analyzer 系統相結合，研究了(le／liǎo) DNA 的(de)相對豐度和(hé / huò)定位（管腔内或與 EV 表面相關）。爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)闡明 EV-DNA 在(zài) EV 亞群之(zhī)間的(de)異質性，對分離的(de) EV 進行 DNA 分析通過密度梯度離心或不(bù)對稱流場-流分餾已經進行。盡管批量分析能夠識别不(bù)同 EV 亞群中的(de) DNA，但結果可能存在(zài)争議，因爲(wéi / wèi) EV-DNA 無法與無細胞 DNA 區分開來(lái)。由于(yú) EV 的(de)大(dà)小和(hé / huò)貨物含量差異很大(dà)，因此迫切需要(yào / yāo)單粒子(zǐ)技術來(lái)破譯 EV-DNA 的(de)内在(zài)異質性，并将 EV-DNA 與遊離 DNA 或其他(tā)污染物區分開來(lái)。然而(ér)，EV 的(de)納米級粒徑（大(dà)多數大(dà)小 <100 nm）和(hé / huò) EV-DNA 的(de)低含量使其成爲(wéi / wèi)一(yī / yì ／yí)個(gè)挑戰。
在(zài)過去的(de)十年中，研究人(rén)員一(yī / yì ／yí)直緻力于(yú)開發一(yī / yì ／yí)種高靈敏度的(de)納米流式細胞儀。它已實現對單個(gè) EV、病毒、二氧化矽納米粒子(zǐ)和(hé / huò)金納米粒子(zǐ)的(de)光散射檢測，分别小至 40、27、24 和(hé / huò) 7 nm。對于(yú)熒光 (FL) 檢測，檢測到(dào)單個(gè) R-藻紅蛋白分子(zǐ)的(de)信噪比爲(wéi / wèi) 17，有機染料的(de)檢測限确定爲(wéi / wèi)三個(gè) Alexa Fluor 532 分子(zǐ)。
在(zài)本研究中，嘗試通過将酶消化與 nFCM 相結合，在(zài)單囊泡水平上(shàng)分析外部和(hé / huò)内部 EV-DNA。研究了(le／liǎo) DNA+ EV 的(de)百分比以(yǐ)及 DNA 含量分布與 EV 大(dà)小、ssDNA 和(hé / huò) dsDNA 之(zhī)間的(de)區别、EV-DNA 和(hé / huò)組蛋白的(de)關聯以(yǐ)及抗癌藥物治療後 DNA 含量的(de)改變。通過同時(shí)對單個(gè)顆粒進行側向散射和(hé / huò)熒光 (FL) 檢測并結合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體相關的(de) DNA 大(dà)量存在(zài)于(yú)由細胞培養物制備的(de) EV 樣品中（超速離心培養基）； (2) 單個(gè) EVs 中 EV-DNA 的(de)數量表現出(chū)很大(dà)的(de)異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的(de)數量在(zài) 30% 到(dào) 80% 之(zhī)間變化，具體取決于(yú)細胞類型； (3) 外部 EV-DNA 主要(yào / yāo)定位在(zài)相對較小的(de) EVs 上(shàng)（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外部 DNA+ EVs 的(de)分泌可以(yǐ)通過抑制外泌體分泌途徑顯著減少； (4) 内部 EV-DNA 主要(yào / yāo)封裝在(zài)相對較大(dà)的(de) EV 的(de)管腔内（例如 HCT-15 細胞系爲(wéi / wèi) 80-200 nm）； (5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是(shì)外部和(hé / huò)内部 EV-DNA 的(de)主要(yào / yāo)形式； (6) EVs 中未發現組蛋白 (H3)，EV-DNA 與組蛋白不(bù)相關，(7) 基因毒性藥物誘導 DNA+ EVs 的(de)釋放增加，外部DNA+ EVs和(hé / huò)内部DNA+ EVs的(de)數量以(yǐ)及單個(gè)EVs中的(de)DNA含量均顯着增加。這(zhè)項研究爲(wéi / wèi)深入了(le／liǎo)解 DNA 與EV的(de)關聯提供了(le／liǎo)直接和(hé / huò)确鑿的(de)實驗證據。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206
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