不(bù)管是(shì)在(zài)藥物研發還是(shì)基礎科研中，檢測蛋白與小分子(zǐ)的(de)相互作用都是(shì)一(yī / yì ／yí)類重要(yào / yāo)的(de)實驗。小分子(zǐ)最主要(yào / yāo)的(de)特點是(shì)分子(zǐ)量較小，一(yī / yì ／yí)般在(zài)1000 Da以(yǐ)下；并且結構性質各異，部分溶解度較差，需要(yào / yāo)使用有機溶劑（例如DMSO等）促溶；這(zhè)些特點給相互作用的(de)檢測帶來(lái)很大(dà)的(de)挑戰。基于(yú)SPR（表面等離子(zǐ)體共振）原理的(de)Biacore系統具有靈敏度高、可進行溶劑校正等優勢，不(bù)僅可以(yǐ)檢測較低的(de)信号，且對分子(zǐ)量差異懸殊的(de)互作類型也(yě)能精确檢測，同時(shí)還能消除有機溶劑帶來(lái)的(de)影響，因此越來(lái)越多的(de)研究者選擇Biacore進行蛋白與小分子(zǐ)相互作用檢測。

我們将根據智荟專線收集到(dào)的(de)客戶反饋，針對Biacore系統檢測蛋白與小分子(zǐ)相互作用實驗中常出(chū)現的(de)代表性問題，分上(shàng)下兩篇進行簡單的(de)分享與讨論。本篇爲(wéi / wèi)上(shàng)篇，将主要(yào / yāo)圍繞實驗設計和(hé / huò)樣品準備方面的(de)問題展開介紹。

一(yī / yì ／yí)、配體的(de)固定策略以(yǐ)及芯片的(de)選擇

對于(yú)配體（固定相）采用合理的(de)固定方式并達到(dào)所需的(de)固定量，是(shì)Biacore實驗邁向成功的(de)第一(yī / yì ／yí)步。然而(ér)所有基于(yú)傳感器表面的(de)檢測技術，都會面臨“物質遷移效應”的(de)影響，所以(yǐ)根據實驗類型及科學的(de)偶聯量計算公式去控制偶聯量非常關鍵。爲(wéi / wèi)此，目前僅有Biacore具備這(zhè)樣嚴謹的(de)計算公式，這(zhè)其中固定量的(de)計算方式主要(yào / yāo)就(jiù)是(shì)參考以(yǐ)下核心方程式，并且其不(bù)僅适用于(yú)直接偶聯法的(de)偶聯量計算，也(yě)可用于(yú)捕獲法的(de)捕獲量計算：

公式中，RL爲(wéi / wèi)配體的(de)固定量，Rmax爲(wéi / wèi)芯片表面的(de)最大(dà)結合容量，Sm爲(wéi / wèi)化學計量比（未知情況時(shí)可先設爲(wéi / wèi)1）。此公式可以(yǐ)簡單理解爲(wéi / wèi)，Biacore中産生的(de)響應值信号反映的(de)是(shì)芯片表面質量的(de)變化。一(yī / yì ／yí)般情況下，對于(yú)動力學分析，要(yào / yāo)求Rmax ≤ 50 RU；對于(yú)親和(hé / huò)力分析，要(yào / yāo)求Rmax ≤ 100 RU。由此計算得到(dào)理論固定量RL，在(zài)偶聯法中實際固定量可能需要(yào / yāo)1.5~3RL；在(zài)捕獲法中，則可以(yǐ)按照理論固定量來(lái)設定配體的(de)捕獲量，因爲(wéi / wèi)捕獲過程的(de)分子(zǐ)朝向固定，條件一(yī / yì ／yí)般也(yě)是(shì)溫和(hé / huò)的(de)接近中性，最大(dà)程度地(dì / de)保留的(de)配體分子(zǐ)的(de)活性。

對于(yú)上(shàng)面的(de)核心方程式有了(le／liǎo)基本的(de)了(le／liǎo)解之(zhī)後，就(jiù)可以(yǐ)回答下面這(zhè)些問題了(le／liǎo)。

1是(shì)選擇固定蛋白還是(shì)固定小分子(zǐ)？

首先需要(yào / yāo)明确的(de)是(shì)，如果您的(de)實驗目的(de)是(shì)想獲得精确的(de)親和(hé / huò)力數值，那建議選擇固定蛋白。考慮到(dào)小分子(zǐ)的(de)固定難度、空間位阻以(yǐ)及固定過程對于(yú)結合的(de)影響等方面的(de)問題，選擇氨基偶聯的(de)方式固定蛋白往往是(shì)最簡單、有效的(de)固定方式。而(ér)小分子(zǐ)本身的(de)活性基團有限，基團的(de)反應活性也(yě)與蛋白存在(zài)一(yī / yì ／yí)定的(de)差異，偶聯條件需要(yào / yāo)摸索，另外，通過這(zhè)些基團的(de)偶聯反應可能也(yě)破壞了(le／liǎo)小分子(zǐ)僅有的(de)結合反應活性位點。因此，隻有對于(yú)某些特定類型的(de)定性實驗，比如分子(zǐ)垂釣，固定小分子(zǐ)也(yě)是(shì)可行的(de)，通常推薦的(de)固定方式是(shì)使用SA芯片固定生物素修飾後的(de)小分子(zǐ)，可以(yǐ)在(zài)比較明确的(de)條件下實現穩定的(de)固定，而(ér)且生物素分子(zǐ)在(zài)一(yī / yì ／yí)定程度上(shàng)可以(yǐ)起到(dào)間隔臂（spacer arm）的(de)作用，減少小分子(zǐ)結合受到(dào)的(de)空間位阻影響。

綜上(shàng)所述，固定蛋白的(de)過程相對簡單也(yě)适用于(yú)大(dà)多數結合反應，因此是(shì)目前探究蛋白與小分子(zǐ)互作時(shí)最常用的(de)選擇。

2固定蛋白是(shì)選擇直接偶聯還是(shì)捕獲法？

先說(shuō)結論：我們建議，進行蛋白與小分子(zǐ)互作實驗時(shí)優先考慮直接偶聯蛋白的(de)方式。

直接偶聯（氨基偶聯）法的(de)操作方法較簡便、明确，而(ér)且可以(yǐ)實現較高的(de)偶聯量，在(zài)小分子(zǐ)作爲(wéi / wèi)分析物時(shí)，有利于(yú)獲得比較理想的(de)響應值。例如常用的(de)CM5芯片，最高偶聯量可以(yǐ)到(dào)10000 – 15000 RU，非常适合蛋白與小分子(zǐ)此類分子(zǐ)量差異懸殊的(de)檢測。除了(le／liǎo)直接偶聯法以(yǐ)外，根據樣品性質與分子(zǐ)量差異，捕獲法也(yě)是(shì)一(yī / yì ／yí)種您可以(yǐ)選擇的(de)固定策略，例如：待固定的(de)樣品未經純化，含有其他(tā)雜質；或者擔心直接偶聯的(de)過程會影響結合位點等。在(zài)這(zhè)些情況下，可以(yǐ)考慮通過捕獲法固定配體。當配體樣品的(de)純度不(bù)夠時(shí)，捕獲的(de)過程相當于(yú)在(zài)芯片表面進行了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)次在(zài)線純化；捕獲過程的(de)條件較爲(wéi / wèi)溫和(hé / huò)，可以(yǐ)盡可能地(dì / de)保留配體的(de)結合活性，同時(shí)保證配體自由朝向，充分暴露結合位點。

常用的(de)捕獲類芯片以(yǐ)NTA芯片爲(wéi / wèi)例，這(zhè)是(shì)一(yī / yì ／yí)種可以(yǐ)通過螯合鎳離子(zǐ)捕獲帶有His标簽蛋白的(de)捕獲芯片。如下圖1所示，NTA芯片上(shàng)捕獲量大(dà)約在(zài)3000 – 4000 RU[1]最爲(wéi / wèi)穩定，非常适合His标簽蛋白與小分子(zǐ)二者分子(zǐ)量差異不(bù)是(shì)特别大(dà)的(de)親和(hé / huò)力檢測。

1. 在(zài)NTA芯片上(shàng)，不(bù)同捕獲量水平下基線的(de)穩定情況[1]。

3氨基偶聯蛋白配體是(shì)選擇CM5芯片還是(shì)CM7芯片？

CM5與CM7芯片表面均爲(wéi / wèi)羧甲基化修飾的(de)葡聚糖基質，兩者最主要(yào / yāo)的(de)區别是(shì)CM7芯片的(de)羧基含量顯著高于(yú)CM5芯片，因此可以(yǐ)實現更高的(de)偶聯量。圖2比較了(le／liǎo)三對蛋白與小分子(zǐ)的(de)互作在(zài)CM5和(hé / huò)CM7芯片上(shàng)的(de)結果差異，可以(yǐ)看到(dào)同一(yī / yì ／yí)組互作實驗，在(zài)CM7芯片上(shàng)可以(yǐ)達到(dào)的(de)偶聯量和(hé / huò)分析物響應值爲(wéi / wèi)CM5芯片的(de)3倍以(yǐ)上(shàng) [2] 。

2. 三組蛋白與小分子(zǐ)互作在(zài)CM5和(hé / huò)CM7芯片上(shàng)的(de)偶聯量與分析物響應值比較[2]。

如上(shàng)所述，CM5芯片的(de)最高偶聯量在(zài)10000 – 15000 RU左右，如果按照固定量計算公式得到(dào)的(de)理論偶聯量遠超這(zhè)個(gè)範圍，則可以(yǐ)考慮使用CM7芯片。簡單來(lái)說(shuō)，當蛋白與小分子(zǐ)的(de)分子(zǐ)量比值大(dà)于(yú)100時(shí)，就(jiù)建議考慮換用CM7芯片。

二、樣品準備的(de)相關問題

在(zài)确定了(le／liǎo)配體的(de)固定策略，并選定了(le／liǎo)相應的(de)芯片之(zhī)後，就(jiù)可以(yǐ)開始下一(yī / yì ／yí)步的(de)實驗了(le／liǎo)。進入試劑、樣品的(de)準備階段，又會遇到(dào)哪些問題呢？我們接着往下看。

如何選擇運行緩沖液？

目前Cytiva供應的(de)用于(yú)Biacore實驗的(de)運行緩沖液主要(yào / yāo)有兩大(dà)類，分别是(shì)基于(yú)HEPES緩沖體系的(de)HBS系列緩沖液與基于(yú)磷酸鹽緩沖體系的(de)PBS系列緩沖液。

在(zài)選擇運行緩沖液時(shí)，并沒有明确的(de)規定必須使用何種緩沖液，應該根據分子(zǐ)互作的(de)自身性質選擇合适的(de)緩沖液。一(yī / yì ／yí)般來(lái)說(shuō)，有以(yǐ)下經驗可供參考：當分析物是(shì)小分子(zǐ)的(de)情況下可以(yǐ)首先嘗試PBS 或者PBS-P+緩沖液；而(ér)分析物爲(wéi / wèi)蛋白時(shí)可以(yǐ)首先嘗試HBS或者HBS-EP+緩沖液。

在(zài)一(yī / yì ／yí)些情況下，小分子(zǐ)的(de)溶解需要(yào / yāo)一(yī / yì ／yí)定濃度的(de)有機溶劑助溶，例如5% DMSO等，而(ér)這(zhè)些有機溶劑在(zài)不(bù)同樣品之(zhī)間的(de)濃度差異會幹擾響應值信号，因此需要(yào / yāo)對這(zhè)部分由運行緩沖液造成的(de)信号進行校正——溶劑校正。而(ér)有機溶劑自動校正的(de)功能，也(yě)是(shì)Biacore的(de)絕活兒之(zhī)一(yī / yì ／yí)，充分保證了(le／liǎo)最終實驗結果真實可信。關于(yú)溶劑校正的(de)相關問題将在(zài)下篇中進行讨論。

需要(yào / yāo)準備多少的(de)蛋白用來(lái)偶聯？

實驗準備的(de)配體蛋白量，至少要(yào / yāo)足夠其達到(dào)所需的(de)偶聯量。下表展示了(le／liǎo)要(yào / yāo)達到(dào)不(bù)同的(de)偶聯水平時(shí)所需的(de)配體濃度以(yǐ)及相應的(de)配體偶聯時(shí)間（流速爲(wéi / wèi)10 μL/min），可供參考[3]。需要(yào / yāo)注意的(de)是(shì)，表中列出(chū)的(de)“配體工作濃度”是(shì)用偶聯緩沖液醋酸鈉稀釋配體蛋白樣品後的(de)濃度。爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)讓稀釋後的(de)蛋白樣品能夠充分富集在(zài)芯片表面，醋酸鈉的(de)稀釋倍數一(yī / yì ／yí)般要(yào / yāo)在(zài)20倍以(yǐ)上(shàng)；如果稀釋倍數不(bù)夠，将影響配體蛋白偶聯效率。因此，準備配體蛋白母液時(shí)最好在(zài)工作濃度的(de)20倍以(yǐ)上(shàng)。

表1. 偶聯量與配體工作濃度參考表[3]。

對于(yú)一(yī / yì ／yí)個(gè)未知的(de)實驗，摸索合适的(de)偶聯量等過程是(shì)必不(bù)可少的(de)，因此對于(yú)蛋白配體的(de)用量也(yě)不(bù)應僅限于(yú)夠一(yī / yì ／yí)次偶聯實驗使用。一(yī / yì ／yí)般的(de)建議是(shì)，配體蛋白的(de)準備量在(zài)1 mg/mL濃度、50 μL以(yǐ)上(shàng)。但即便如此，老師們也(yě)能清晰的(de)算出(chū)來(lái)Biacore對于(yú)蛋白的(de)用量非常低，遠遠優于(yú)您其他(tā)的(de)互作檢測手段。

小分子(zǐ)分析物的(de)濃度範圍如何确定？

不(bù)管在(zài)動力學（Kinetics）分析還是(shì)在(zài)親和(hé / huò)力（Affinity）分析中，分析物濃度範圍的(de)确定均與結合反應的(de)解離平衡常數（KD）有關。一(yī / yì ／yí)般設置的(de)分析物濃度梯度範圍如果能夠覆蓋KD值，将會達到(dào)較準确的(de)拟合結果。在(zài)動力學分析中，一(yī / yì ／yí)個(gè)理想的(de)分析物濃度範圍可以(yǐ)從10 × KD作爲(wéi / wèi)最高濃度進行梯度稀釋；在(zài)親和(hé / huò)力分析中，理想的(de)分析物濃度範圍可以(yǐ)選擇從2 × KD的(de)濃度作爲(wéi / wèi)最高濃度進行梯度稀釋[4]。對于(yú)蛋白與小分子(zǐ)的(de)互作，大(dà)多數情況下是(shì)“快結合快解離”的(de)模式，适用于(yú)親和(hé / huò)力分析的(de)模型（關于(yú)數據分析中模型選擇的(de)問題，将會在(zài)下篇中進行讨論）。蛋白與小分子(zǐ)結合反應的(de)KD值，基本都在(zài)μM級别，因此可以(yǐ)将小分子(zǐ)最高濃度設爲(wéi / wèi)1000 μM，按照3倍甚至5倍的(de)稀釋比例來(lái)配制濃度梯度（拉大(dà)範圍）。進行這(zhè)樣的(de)初步實驗後，基本可以(yǐ)确定反應KD值的(de)大(dà)緻範圍，後續可以(yǐ)調整濃度範圍、減小稀釋比例再進行進一(yī / yì ／yí)步實驗。當然，小分子(zǐ)能夠達到(dào)的(de)最高濃度還受到(dào)溶解度等因素的(de)影響。

以(yǐ)上(shàng)是(shì)針對Biacore檢測蛋白與小分子(zǐ)互作的(de)實驗方案設計以(yǐ)及樣品準備方面的(de)常見問題分享。良好的(de)開端是(shì)成功的(de)一(yī / yì ／yí)半，合理的(de)活性配體偶聯量、分析物濃度範圍以(yǐ)及運行緩沖液選擇，将幫助我們得到(dào)更理想的(de)實驗結果。在(zài)下篇中我們将繼續分享關于(yú)實驗進行以(yǐ)及數據分析方面的(de)常見問題，敬請期待！

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