在(zài)《Biacore檢測蛋白與小分子(zǐ)相互作用的(de)常見問題（上(shàng)）》中我們着重介紹了(le／liǎo)在(zài)實驗設計以(yǐ)及樣品準備方面的(de)問題，在(zài)本文的(de)下篇中，我們還是(shì)從智荟專線收集的(de)客戶咨詢出(chū)發，将繼續讨論在(zài)實驗進行過程中和(hé / huò)最終的(de)數據分析階段可能遇到(dào)的(de)常見問題，并逐一(yī / yì ／yí)揭開上(shàng)篇中遺留的(de)各個(gè)懸念……

一(yī / yì ／yí)、 關于(yú)溶劑校正的(de)問題

溶劑校正流程貫穿于(yú)前期的(de)樣品準備、之(zhī)後的(de)樣品檢測以(yǐ)及最後的(de)數據分析，是(shì)檢測蛋白與小分子(zǐ)相互作用實驗中非常關鍵的(de)一(yī / yì ／yí)個(gè)步驟，也(yě)是(shì)Biacore檢測蛋白與小分子(zǐ)互作的(de)一(yī / yì ／yí)大(dà)優勢。

什麽情況下需要(yào / yāo)進行溶劑校正？

當運行緩沖液中含有高折光率（refractive index）的(de)成分，且此時(shí)在(zài)活通道(dào)上(shàng)的(de)配體量較高時(shí)，運行緩沖液流經活性通道(dào)時(shí)會存在(zài)一(yī / yì ／yí)定的(de)體積排阻效應，導緻活性通道(dào)與參比通道(dào)上(shàng)的(de)信号存在(zài)差異[1]（如下圖1所示）。

1. 運行緩沖液的(de)高折光率與高偶聯造成活性通道(dào)與參比通道(dào)的(de)信号差異[1]。

如果運行緩沖液以(yǐ)及不(bù)同濃度的(de)分析物樣品的(de)折光率能保持嚴格一(yī / yì ／yí)緻，則上(shàng)述的(de)通道(dào)間差異也(yě)是(shì)一(yī / yì ／yí)個(gè)定值了(le／liǎo)，将不(bù)會對最終互作結果産生影響；然而(ér)實際情況下，由于(yú)樣品配制誤差等原因，緩沖液與分析物樣品間的(de)折光率誤差往往難以(yǐ)避免。以(yǐ)DMSO爲(wéi / wèi)例，1% DMSO的(de)加入會導緻響應值信号上(shàng)升約1200 RU[1]，而(ér)小分子(zǐ)分析物本身與配體結合産生的(de)響應值是(shì)較小的(de)，因此DMSO濃度的(de)微小變化也(yě)會引起顯著的(de)影響。此時(shí)就(jiù)需要(yào / yāo)進行溶劑校正，來(lái)修正這(zhè)種由于(yú)高折光率物質（例如DMSO等）濃度的(de)細微偏差導緻的(de)響應值信号顯著變化，得到(dào)最準确的(de)互作數據。

2如何進行溶劑校正？

以(yǐ)最常見的(de)DMSO爲(wéi / wèi)例，溶劑校正的(de)核心思路是(shì)設置一(yī / yì ／yí)系列含有不(bù)同濃度DMSO的(de)校正溶液，濃度範圍覆蓋實驗中所用的(de)DMSO濃度（例如運行緩沖液和(hé / huò)分析物樣品中均含5% DMSO，則校正溶液中濃度範圍可以(yǐ)是(shì)4.5% - 5.8%），以(yǐ)此來(lái)包含樣品與buffer配制過程中引入的(de)DMSO濃度的(de)誤差。使校正溶液按照濃度順序（從低到(dào)高或者從高到(dào)低）依次進樣，流經參比通道(dào)與活性通道(dào)後，以(yǐ)參比通道(dào)的(de)響應值爲(wéi / wèi)橫坐标、活性通道(dào)扣減參比通道(dào)的(de)響應值爲(wéi / wèi)縱坐标進行作圖，得到(dào)溶劑校正曲線（如下圖2所示）。根據樣品在(zài)參比通道(dào)的(de)信号，就(jiù)可以(yǐ)通過校正曲線對應得到(dào)活性通道(dào)扣減參比通道(dào)的(de)校正值。而(ér)此過程在(zài)Biacore上(shàng)，都是(shì)全自動完成的(de)，有專用向導式程序指引，無需手動操作。

2. 典型的(de)溶劑校正曲線示意圖[1]。

3

如何判斷溶劑校正的(de)結果是(shì)否正常？

如果按照上(shàng)述的(de)例子(zǐ)，對含有5% DMSO的(de)樣品以(yǐ)4.5% - 5.8%的(de)範圍進行溶劑校正，最終得到(dào)的(de)溶劑校正曲線橫坐标範圍一(yī / yì ／yí)般要(yào / yāo)落在(zài)-500 到(dào) +1000 RU，校正曲線圖譜中的(de)兩條豎線代表的(de)是(shì)分析物中DMSO濃度範圍，要(yào / yāo)求落在(zài)校正曲線的(de)範圍内，并且拟合的(de)Chi²值小于(yú)2[1][2]。

如果溶劑校正的(de)結果出(chū)現異常，可以(yǐ)留意以(yǐ)下幾方面的(de)問題：（1）建議使用高品質的(de)DMSO試劑，并且使用相同來(lái)源的(de)DMSO溶解小分子(zǐ)和(hé / huò)配制所需溶液。（2）注意校正溶液的(de)配制策略，例如隻需配制含4.5%和(hé / huò)5.8% DMSO的(de)這(zhè)兩種緩沖液，中間梯度通過這(zhè)兩種溶液按照不(bù)同比例混合得到(dào)，而(ér)不(bù)需要(yào / yāo)一(yī / yì ／yí)個(gè)個(gè)單獨配制。（3）由于(yú)DMSO具有吸潮的(de)性質，在(zài)配制過程中應及時(shí)封閉，避免長時(shí)間敞口放置；在(zài)上(shàng)機檢測時(shí)，也(yě)應該對樣品管進行密封。爲(wéi / wèi)此，Biacore獨特的(de)全密閉樣品艙設計，及配套專用的(de)孔闆封膜及EP管橡膠蓋就(jiù)派上(shàng)用場了(le／liǎo)。

關于(yú)溶劑校正步驟的(de)具體操作方法，可以(yǐ)掃描文末二維碼，查閱《Easy Biacore: T200 檢測蛋白與小分子(zǐ)結合》中的(de)相關内容。

二、結果分析中的(de)相關問題

正确的(de)溶劑校正是(shì)後續進行數據分析的(de)前提，得到(dào)最終可分析的(de)結果後，可能還面臨下面這(zhè)些問題。

1

應該選擇哪種拟合模式？

關于(yú)拟合模式的(de)選擇，是(shì)選擇動力學（Kinetics）分析還是(shì)親和(hé / huò)力（Affinity）分析，主要(yào / yāo)是(shì)根據響應值圖譜的(de)形狀來(lái)判斷的(de)。對于(yú)動力學分析，要(yào / yāo)求響應值圖譜在(zài)結合和(hé / huò)解離階段均展現出(chū)足夠的(de)曲率（“慢結合慢解離”），而(ér)親和(hé / huò)力分析則要(yào / yāo)求在(zài)每次的(de)分析物進樣階段均達到(dào)穩态（steady state）。對于(yú)同時(shí)滿足兩種要(yào / yāo)求的(de)響應值圖譜，理論上(shàng)兩種分析模式均可以(yǐ)使用。關于(yú)不(bù)同響應值圖譜形狀以(yǐ)及可選的(de)拟合模式，可參考如下圖3[3]。

3. 不(bù)同形狀的(de)響應值圖譜與适用的(de)拟合模式的(de)對應關系示意圖[3]。

如同在(zài)上(shàng)篇所提到(dào)的(de)，蛋白與小分子(zǐ)的(de)相互作用在(zài)大(dà)部分情況下是(shì)“快結合快解離”的(de)，在(zài)結合與解離階段的(de)曲線未能呈現足夠的(de)曲率，而(ér)在(zài)每次分析物進樣後，曲線快速上(shàng)升并達到(dào)平台，因此适用于(yú)親和(hé / huò)力（Affinity）分析。而(ér)在(zài)解離階段曲線快速下降至接近基線的(de)特點，也(yě)使得蛋白與小分子(zǐ)互作檢測中一(yī / yì ／yí)般不(bù)需要(yào / yāo)設置額外的(de)再生步驟。

2

如何判斷拟合結果的(de)好壞？

這(zhè)是(shì)很多實驗者在(zài)面對自己的(de)實驗結果時(shí)會發出(chū)的(de)“靈魂拷問”，同樣也(yě)是(shì)Biacore另一(yī / yì ／yí)個(gè)獨特優勢體現之(zhī)處：具有智能數據質量評估系統，能夠以(yǐ)圖形化顯示方式來(lái)評估檢測結果。能夠對檢測結果自動進行統計學分析，并給出(chū)相應參數，以(yǐ)此判斷數據可信度與準确度。由于(yú)篇幅有限，我們這(zhè)裏主要(yào / yāo)讨論蛋白與小分子(zǐ)互作常用的(de)親和(hé / huò)力分析結果的(de)評價。

是(shì)使用Biacore結果分析軟件得到(dào)的(de)典型的(de)親和(hé / huò)力分析結果，在(zài)Report界面，顯示的(de)參數有KD（以(yǐ)M爲(wéi / wèi)單位）、Rmax、offset以(yǐ)及Chi²，相應的(de)判斷标準如下：

1

拟合得出(chū)的(de)KD值（即拟合曲線中豎線所在(zài)的(de)橫坐标值）應該盡可能落在(zài)分析物濃度範圍之(zhī)内，最好在(zài)最高濃度的(de)一(yī / yì ／yí)半以(yǐ)内。

2

當拟合得到(dào)的(de)實際Rmax值顯著高于(yú)理論計算值時(shí)，說(shuō)明結合反應未按照1：1的(de)化學計量比進行，有可能出(chū)現了(le／liǎo)非特異性結合或者分析物分子(zǐ)的(de)聚集。對于(yú)小分子(zǐ)樣品來(lái)說(shuō)，往往由于(yú)溶解度等問題發生聚集導緻上(shàng)述現象。而(ér)造成拟合得到(dào)的(de)實際Rmax值低于(yú)理論計算值的(de)原因，主要(yào / yāo)還是(shì)偶聯的(de)配體中有一(yī / yì ／yí)定比例的(de)分子(zǐ)未充分暴露結合活性。如果上(shàng)述兩種情況同時(shí)存在(zài)，此時(shí)僅通過Rmax值難以(yǐ)判斷，需要(yào / yāo)通過其他(tā)實驗結果來(lái)驗證。

3

offset代表的(de)是(shì)零濃度時(shí)的(de)響應值，這(zhè)個(gè)值應該趨近于(yú)0；如果出(chū)現了(le／liǎo)異常高的(de)值或者負值，需要(yào / yāo)檢查參比通道(dào)和(hé / huò)零濃度的(de)響應值 [3] 。

4

Chi²值反映了(le／liǎo)拟合結果與實驗數據的(de)接近程度，這(zhè)個(gè)值越小，代表實驗結果與拟合模型越接近。

4. Biacore分析軟件中典型的(de)親和(hé / huò)力拟合結果界面 [2] 。

3

 關于(yú)非特異性吸附的(de)問題

非特異性吸附的(de)來(lái)源是(shì)多樣的(de)，最常見的(de)應該是(shì)分析物分子(zǐ)在(zài)參比通道(dào)芯片表面的(de)吸附，其次可能還來(lái)源于(yú)分析物樣品中其他(tā)雜質成分在(zài)參比通道(dào)或者配體上(shàng)的(de)非特異性結合，甚至還可能是(shì)分析物分子(zǐ)在(zài)配體上(shàng)的(de)吸附（例如小分子(zǐ)在(zài)配體蛋白非活性位點的(de)弱結合等）。要(yào / yāo)判斷是(shì)否存在(zài)非特異性吸附，最主要(yào / yāo)的(de)判斷依據是(shì)看Binding to reference這(zhè)部分參數，該參數反映了(le／liǎo)每個(gè)循環的(de)分析物在(zài)參比通道(dào)上(shàng)的(de)吸附情況。作爲(wéi / wèi)建議，可以(yǐ)按照以(yǐ)下标準判斷：如果Binding to reference的(de)值大(dà)于(yú)活性通道(dào)扣減參比通道(dào)（如Fc=2-1）得到(dào)信号值的(de)20%，則可以(yǐ)認爲(wéi / wèi)存在(zài)較顯著的(de)非特異性吸附。

要(yào / yāo)解決非特異性吸附問題，主要(yào / yāo)可以(yǐ)從以(yǐ)下三方面入手：

1

改變芯片表面或者分析物的(de)性質。比較直接的(de)方法是(shì)調換配體與分析物的(de)位置，即固定會發生非特異性吸附的(de)原分析物，将原配體作爲(wéi / wèi)分析物流經芯片表面進行分析。然而(ér)在(zài)蛋白與小分子(zǐ)的(de)互作實驗中，固定小分子(zǐ)會面臨諸多問題（如上(shàng)篇中所述），因此這(zhè)個(gè)方案在(zài)解決小分子(zǐ)的(de)非特異性吸附中不(bù)常用。其次可以(yǐ)考慮改變參比通道(dào)的(de)處理方法。在(zài)使用CM系列芯片偶聯配體進行檢測時(shí)，參比通道(dào)可以(yǐ)不(bù)作任何處理，也(yě)可以(yǐ)進行活化與封閉。這(zhè)兩種處理方式下的(de)芯片表面性質有所不(bù)同，改變處理方式或許可以(yǐ)減弱非特異性吸附。另外，非特異性吸附的(de)來(lái)源還可能是(shì)分析物中的(de)雜質，那麽提高分析物的(de)純度可能也(yě)有助于(yú)減弱這(zhè)種吸附。

2

改變緩沖液條件抑制吸附的(de)發生。非特異性吸附發生所依賴的(de)作用力主要(yào / yāo)就(jiù)是(shì)離子(zǐ)型相互作用或者疏水型相互作用，前者可以(yǐ)通過提高離子(zǐ)強度來(lái)抑制，而(ér)後者可以(yǐ)通過添加一(yī / yì ／yí)定濃度的(de)表面活性劑進行屏蔽。常規緩沖液中NaCl濃度在(zài)150 mM附近，可以(yǐ)考慮在(zài)原運行緩沖液中額外添加鹽（至~300 mM甚至500 mM）。Cytiva提供含有表面活性劑P20的(de)運行緩沖液，工作濃度一(yī / yì ／yí)般爲(wéi / wèi)0.05%。需要(yào / yāo)注意的(de)是(shì)，在(zài)提高鹽濃度或者加入表面活性劑的(de)過程中，配體與分析物的(de)相互作用可能也(yě)會受到(dào)一(yī / yì ／yí)定程度的(de)影響。

3

調整分析物的(de)濃度範圍。非特異性吸附往往呈現出(chū)非常明顯的(de)濃度相關性。對于(yú)小分子(zǐ)分析物，有可能發生的(de)情況是(shì)，當濃度達到(dào)某個(gè)值以(yǐ)上(shàng)時(shí)，小分子(zǐ)的(de)溶解情況出(chū)現變化，容易發生聚集沉澱等問題，導緻非特異性吸附的(de)信号陡然上(shàng)升。對于(yú)上(shàng)述情況，可以(yǐ)考慮調整分析物的(de)濃度範圍，将非特異性吸附的(de)信号控制在(zài)相對不(bù)顯著的(de)範圍之(zhī)内進行實驗。當然，分析物的(de)濃度範圍的(de)确定還要(yào / yāo)考慮KD拟合的(de)需要(yào / yāo)（如上(shàng)篇中所述），因此這(zhè)個(gè)方法不(bù)一(yī / yì ／yí)定能找到(dào)合适的(de)濃度範圍。

面對實際出(chū)現的(de)非特異性吸附問題時(shí)，往往是(shì)以(yǐ)上(shàng)三方面綜合考慮，進而(ér)嘗試解決。

至此，關于(yú)Biacore檢測蛋白與小分子(zǐ)互作的(de)實驗進行步驟和(hé / huò)數據分析過程的(de)常見問題也(yě)已分享完畢。一(yī / yì ／yí)個(gè)成功的(de)Biacore實驗需要(yào / yāo)在(zài)實驗設計、樣品準備以(yǐ)及結果分析等各階段進行問題的(de)排查與調整，檢測蛋白與小分子(zǐ)互作的(de)實驗中可能會出(chū)現形形色色的(de)問題，但是(shì)造成這(zhè)些問題的(de)主要(yào / yāo)原因應該都在(zài)這(zhè)兩篇讨論的(de)内容中了(le／liǎo)，很多情況下未知的(de)現象往往是(shì)已知的(de)原因導緻的(de)。萬變不(bù)離其宗，希望這(zhè)上(shàng)下兩篇的(de)分享能給大(dà)家帶來(lái)一(yī / yì ／yí)些提示與啓發。

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