實驗一(yī / yì ／yí)：肝素 (Heparin)

中南大(dà)學湘雅三醫院呂奔教授團隊圍繞膿毒症的(de)發病機理及靶向幹預開展了(le／liǎo)系列研究，揭示了(le／liǎo)膿毒症重要(yào / yāo)的(de)緻病機制，爲(wéi / wèi)膿毒症的(de)診治提供了(le／liǎo)潛在(zài)的(de)生物标志物和(hé / huò)藥物幹預靶點，并針對該靶點進行藥物篩選，爲(wéi / wèi)今後膿毒症的(de)防治提供了(le／liǎo)新的(de)思路。

2021年，呂奔教授研究團隊在(zài)Immunity雜志上(shàng)發表文章，針對前序研究中發現的(de)HMGB1-LPS-caspase-11途徑，篩選出(chū)肝素 (Heparin) 能高效并選擇性地(dì / de)抑制Caspase-11活化，并闡明了(le／liǎo)肝素在(zài)膿毒症中能通過抑制Caspase-11的(de)活化防止髒器損傷、DIC發生和(hé / huò)死亡的(de)機制。

觀察圖1的(de)動力學表征數據可知，肝素與HMGB1有較強結合，Kd=5.59*10^^-6 M。同時(shí)，通過多濃度梯度進樣的(de)實驗設計，可以(yǐ)看出(chū)LPS+Heparin實驗組相較LPS對照組，與包被有HMGB1蛋白的(de)芯片的(de)響應值 (Response, RU) 顯著降低，即可看出(chū)Heparin可以(yǐ)抑制LPS與HMGB1的(de)識别/結合。

實驗二：Tuftsin

北京大(dà)學王月丹與初明教授團隊圍繞着新冠病毒的(de)防治工作篩選到(dào)了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)種天然産物Tuftsin，相關成果也(yě)于(yú)2022年發表在(zài)Frontiers in Molecular Biosciences雜志上(shàng)。Tuftsin是(shì)機體脾髒産生的(de)一(yī / yì ／yí)段生理活性肽，其基本功能是(shì)刺激巨噬細胞和(hé / huò)粒細胞，提高促吞噬的(de)能力；可以(yǐ)通過增強效應細胞的(de)細胞毒功能殺傷腫瘤細胞等，在(zài)抗感染方面具有不(bù)能替代的(de)作用。

通過多輪的(de)化藥庫篩選、分子(zǐ)對接等實驗，課題組篩選到(dào)Tuftsin分子(zǐ)。随後，使用Biacore體外驗證了(le／liǎo)其與ACE2分子(zǐ)及抑制的(de)效應分子(zǐ)NRP1的(de)親和(hé / huò)力，結果表明Tuftsin能特異性識别并結合ACE2分子(zǐ)。

此外，研究人(rén)員通過多濃度梯度進樣的(de)實驗設計，将S1蛋白固定在(zài)CM5芯片上(shàng)，設置ACE2 (5 nM) 對照組及Tuftsin+ACE2（ACE2爲(wéi / wèi)固定濃度，5 nM; Tuftsin設置9/156/625 nM）實驗組；結果表明，Tuftsin濃度越高，結合響應值 (Response, RU) 越低，即證明Tuftsin可有效阻斷/抑制S1與ACE2的(de)識别與結合。

實驗三：黃連素 (Berberine，BBR) 

首都醫科大(dà)學和(hé / huò)北京中醫藥大(dà)學的(de)科研團隊在(zài)傳統中藥中篩選特異性抑制凝血酶的(de)小分子(zǐ)抑制劑，最終得到(dào)的(de)黃連素 (Berberine，BBR) 被證明可以(yǐ)直接結合凝血酶從而(ér)抑制其誘導的(de)血小闆聚集。凝血酶 (Thrombin) 是(shì)血液凝固級聯反應中的(de)關鍵酶，被認爲(wéi / wèi)是(shì)多種心血管疾病中重要(yào / yāo)的(de)藥物靶點。

研究人(rén)員首先在(zài)Biacore上(shàng)證明了(le／liǎo)Berberine可以(yǐ)直接與凝血酶結合，兩者的(de)親和(hé / huò)力爲(wéi / wèi)16.39 μM（圖3 A/B），比已上(shàng)市的(de)抗凝血藥阿加曲班 (Argatroban) 的(de)親和(hé / huò)力更高（圖3 C/D，KD=53.78 μM）。

同時(shí)，研究人(rén)員利用Biacore的(de)A-B-A進樣設計競争實驗，證明Berberine與Argatroban結合在(zài)Thrombin相同的(de)位點上(shàng)。A-B-A的(de)進樣方式簡化了(le／liǎo)競争實驗的(de)設置，允許兩種不(bù)同的(de)溶液按照溶液A/溶液B/溶液A的(de)順序在(zài)同一(yī / yì ／yí)個(gè)循環内進樣，由于(yú)競争樣品無需再溶解在(zài)運行緩沖液裏，大(dà)大(dà)減少了(le／liǎo)競争樣品的(de)消耗量，非常适用于(yú)藥物的(de)競争分析（圖4）。

從圖5的(de)實驗結果中可以(yǐ)看到(dào)：Berberine不(bù)存在(zài)時(shí)，Argatroban與Thrombin有明顯的(de)結合信号（圖5，red line）；而(ér)在(zài)300 μM Berberine存在(zài)的(de)情況下（A-B-A樣品設置參照圖4），Argatroban與Thrombin的(de)結合響應值明顯降低（圖5，blue line）。證明Berberine在(zài)Thrombin上(shàng)的(de)結合位點與Argatroban是(shì)一(yī / yì ／yí)樣的(de)。綜合後續的(de)血小闆凝集實驗，這(zhè)一(yī / yì ／yí)研究說(shuō)明Berberine是(shì)潛在(zài)的(de)安全有效的(de)凝血酶抑制藥物。

實驗一(yī / yì ／yí)：紫草素 (SHK)

NF-κB是(shì)一(yī / yì ／yí)個(gè)可誘導轉錄因子(zǐ)家族，調節多種生理及病理進程。NEMO/IKKβ複合物則是(shì)NF-κB信号通路中的(de)中心調節劑。2022年，大(dà)連醫科大(dà)學馬骁馳、中國(guó)科學院上(shàng)海藥物研究所果德安、中國(guó)科學院大(dà)連化學物理研究所葉明亮課題組在(zài)Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上(shàng)發表了(le／liǎo)相關成果，篩選到(dào)NEMO/IKKβ複合物的(de)潛在(zài)抑制劑-紫草素 (SHK) 。

爲(wéi / wèi)測得SHK抑制NEMO/IKKβ複合物的(de)IC₅₀，課題組做了(le／liǎo)相關實驗：把MBP-IKKβ蛋白固定在(zài)CM5芯片上(shàng)，再将GST-NEMO+SHK（GST-NEMO爲(wéi / wèi)固定濃度，1 μM; SHK設置0~3125 nM）的(de)預混液以(yǐ)多濃度梯度進樣的(de)形式流過芯片表面，進行結合信号的(de)采集，拟合作圖，測出(chū)IC₅₀。

同時(shí)，課題組考慮到(dào)實驗的(de)嚴謹性，将GST-NEMO作爲(wéi / wèi)固定相進行了(le／liǎo)實驗重複。課題組使用Biacore測得了(le／liǎo)紫草素抑制NEMO/IKKβ複合物的(de)IC₅₀爲(wéi / wèi)174 nM，證明其可在(zài)體内外抑制NF-κB通路，從而(ér)減緩結直腸癌細胞的(de)增殖，爲(wéi / wèi)開發有效的(de)小分子(zǐ)PPI抑制劑提供一(yī / yì ／yí)些新的(de)思路。

倫斯勒理工學院、中國(guó)農業大(dà)學等單位圍繞着綠茶中的(de)抗氧化劑EGCG展開了(le／liǎo)豐富的(de)研究，并于(yú)2021在(zài)NATURE COMMUNICATIONS雜志上(shàng)發表相關成果。文章中闡釋EGCG可與p53分子(zǐ)結合并阻斷p53與MDM2分子(zǐ)（E3泛素連接酶）的(de)結合，從而(ér)抑制MDM2對p53的(de)泛素化、穩定了(le／liǎo)p53的(de)抗腫瘤活性。

課題組首先使用Biacore測定了(le／liǎo)EGCG與全長p53、NTD-p53的(de)親和(hé / huò)力，探明了(le／liǎo)EGCG與p53的(de)識别作用靶點位于(yú)p53分子(zǐ)的(de)N末端。同時(shí)，課題組将MDM2分子(zǐ)固定在(zài)CM5芯片上(shàng)，探究了(le／liǎo)MDM2分子(zǐ)與p53的(de)親和(hé / huò)力KD=0.6±0.1 μM。接着使用同一(yī / yì ／yí)張芯片展開了(le／liǎo)IC₅₀測試：将p53+EGCG（p53爲(wéi / wèi)固定濃度，250 nM; EGCG設置0~500 nM）的(de)預混液以(yǐ)多濃度梯度進樣的(de)形式流過芯片表面，進行結合信号的(de)采集，拟合作圖，測出(chū)IC₅₀=0.2 μM。

小結