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    技術幹貨：一(yī / yì ／yí)文讀懂菌液OD600測量

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        微生物和(hé / huò)細胞生長的(de)光密度（OD）測量是(shì)微生物學及生物發酵實驗室中最常用的(de)方法之(zhī)一(yī / yì ／yí)，用于(yú)在(zài)進行蛋白表達或監測培養過程時(shí)确定收獲的(de)最佳時(shí)間。細胞、細菌或酵母在(zài)液體培養基中的(de)生長情況（細胞密度、細菌生長、酵母生長）通常通過測量600nm下的(de)光密度（OD600）來(lái)獲得。OD600測量通常用于(yú)确定細菌培養物的(de)生長階段，這(zhè)些測量有助于(yú)确保在(zài)适當的(de)細胞密度下收獲細胞。

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        由于(yú)OD600測量的(de)光密度是(shì)由光散射而(ér)非光吸收引起的(de)，因此細胞的(de)大(dà)小和(hé / huò)形狀以(yǐ)及死細胞和(hé / huò)碎片可能會增加光散射。因此，當在(zài)相同的(de)儀器上(shàng)測量時(shí)，處于(yú)相同密度水平（如Cells/mL）的(de)不(bù)同細胞類型可能顯示出(chū)不(bù)同的(de)OD600值。

        細菌細胞的(de)生長通常經曆一(yī / yì ／yí)系列連續的(de)階段，包括滞後、對數、靜止和(hé / huò)衰退。通常，應在(zài)對數期結束時(shí)收獲細胞，使用樣品的(de)光密度OD600來(lái)确定何時(shí)達到(dào)這(zhè)一(yī / yì ／yí)時(shí)間點，是(shì)非常便捷的(de)。在(zài)誘導或收獲之(zhī)前，細胞通常常規生長至OD600達到(dào)約0.4。

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    朗伯-比爾定律與OD600


        朗伯-比爾定律，根據經驗将光的(de)吸收與樣品的(de)濃度聯系起來(lái)。該定律表明，光通過特定樣品的(de)透射率（T=I/Io，其中I=出(chū)射光，Io=入射光）、特定化合物的(de)消光系數（ε）、樣品中具有光吸收的(de)物質的(de)濃度（c）和(hé / huò)光傳播的(de)距離（d）之(zhī)間存在(zài)對數關系。根據朗伯-比爾特定律，OD值與細菌濃度（C）或數量（N）具有類似的(de)定義。然而(ér)，OD600的(de)測量實際上(shàng)是(shì)濁度的(de)測量，因此，我們可以(yǐ)應用朗伯-比爾定律定律，但需要(yào / yāo)進行一(yī / yì ／yí)些額外的(de)考量，如樣品濁度（濃度）的(de)适用範圍，設備收集非散射光的(de)結構等。


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    OD600讀數的(de)差異


        對于(yú)混濁的(de)樣品，如細胞培養物，測量的(de)吸光度的(de)主要(yào / yāo)來(lái)源于(yú)光散射，而(ér)不(bù)是(shì)完全遵循朗伯-比爾定律中的(de)分子(zǐ)吸收的(de)原理。因此，測量取決于(yú)分光光度計的(de)光學設置（比色皿和(hé / huò)儀器出(chū)射狹縫狹縫之(zhī)間的(de)距離、單色器的(de)性能、狹縫幾何形狀等），不(bù)同的(de)儀器類型很可能會爲(wéi / wèi)相同的(de)混濁樣品提供不(bù)同的(de)OD 600讀數。因此，如果要(yào / yāo)比較不(bù)同分光光度計的(de)結果，則必須首先使用兩種不(bù)同儀器上(shàng)的(de)相同樣本進行OD600值比較，并進行相關性的(de)歸一(yī / yì ／yí)化。


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    OD600校正值公式


        NanoPhotometer®或OD600 DiluPhotometer™等儀器默認“校正系數”爲(wéi / wèi)1，如使用相應方法進行調整，将有助于(yú)在(zài)不(bù)同設備之(zhī)間提供可比較的(de)結果。


    OD600校正因子(zǐ)= 設備1測量值 / 設備2測量值


        或者使用創建适當的(de)校準曲線來(lái)采用更精确的(de)方法，可以(yǐ)通過在(zài)不(bù)同濃度範圍内比較測量的(de)OD600與預期的(de)OD600來(lái)構建校準曲線。預期的(de)OD600是(shì)通過使用替代技術（例如顯微鏡載玻片法）進行細胞計數，并使用經驗法則将1個(gè)OD600＝5×108個(gè)cells/ml的(de)大(dà)腸杆菌聯系起來(lái)。


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        通常建議使用試管或比色皿進行OD600測量，以(yǐ)确保讀數的(de)穩定性，較大(dà)體積樣品提供了(le／liǎo)更大(dà)的(de)濁度平均值，誤差相對較小。此外，爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)防止菌體沉降過快，并給出(chū)随時(shí)間變化的(de)OD讀數，可向樣品中添加甘油。對于(yú)一(yī / yì ／yí)些很小的(de)樣品量要(yào / yāo)求，使用微滴進行測量，也(yě)是(shì)可行的(de)，特别是(shì)NanoPhotometer®的(de)樣品壓縮法，在(zài)液膜中測量，可避免液柱中顯著的(de)沉降現象。但需注意在(zài)上(shàng)樣前樣品的(de)充分混勻。

     

        用于(yú)測量的(de)儀器的(de)線性範圍對于(yú)覆蓋培養物的(de)整個(gè)生長周期至關重要(yào / yāo)，建議至少2.5 OD的(de)OD限值以(yǐ)提供足夠的(de)工作範圍。如果存在(zài)大(dà)量的(de)死細胞，使結果模糊不(bù)清，則樣本可能在(zài)整個(gè)範圍内不(bù)是(shì)線性的(de)。如果樣品仍然超出(chū)範圍，則可能需要(yào / yāo)稀釋；應仔細選擇參數以(yǐ)覆蓋整個(gè)所需區域，而(ér)不(bù)影響測量的(de)線性度。


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        爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)減少OD600測量所需的(de)體積，并避免耗時(shí)且容易出(chū)錯的(de)手動稀釋，可以(yǐ)使用特殊的(de)比色皿。Implen的(de)DiluCell™自動稀釋比色皿可降低樣品體積要(yào / yāo)求，并提供自動虛拟樣品稀釋。由于(yú)DiluCell™的(de)獨特設計，光路從标準的(de)10毫米減少到(dào)1毫米（DC 10）。根據朗伯-比爾定律，光程因子(zǐ)爲(wéi / wèi)10。使用DiluCell™自動稀釋可節省時(shí)間，并排除稀釋誤差和(hé / huò)交叉污染。


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        德國(guó)Implen提供多種OD600測量解決方案，包括應用于(yú)基礎測量和(hé / huò)高級工藝開發的(de)不(bù)同機型，具有可靠的(de)測量結果和(hé / huò)豐富的(de)軟件功能，以(yǐ)及合規性功能，能夠充分滿足不(bù)同用戶的(de)需求。OD600測量，認準德國(guó)Implen。


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